흉막 보급의 마우스 모형을 위한 근적외선 광면역요법
Summary
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 항체-광흡수제(IR700Dye) 컨쥬게이트와 NIR 라이트를 활용하여 암세포를 파괴하는 신흥 암 치료 전략이다. 여기서, 우리는 생물발광 이미징을 사용하여 흉막 전파폐암 및 악성 흉막 중피종의 마우스 모델에서 NIR-PIT의 항종양 효과를 평가하는 방법을 제시한다.
Abstract
광면역요법의 효능은 피하요법보다 치열식 마우스 모델로 보다 더 정확하게 평가될 수 있다. 흉막 보급 모델은 폐암 또는 악성 흉막 중피종과 같은 내트라토라시질환에 대한 치료 방법의 평가를 위해 사용될 수 있다.
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 NIR 광에 노출된 후 광흡수제(IR700Dye)에 의한 독성과 종양 표적화 항체의 특이성을 결합한 최근 개발된 암 치료 전략이다. NIR-PIT의 효능은 다양한 항체를 사용하여 보고되고 있다; 그러나, 단지 몇몇 보고는 치열 교정 모형에 있는 이 전략의 치료 효력을 보여주었습니다. 본 연구에서는 NIR-PIT를 사용하여 치료된 흉막 전파폐암 모델의 효능 평가의 예를 시연한다.
Introduction
암은 수십 년간의 연구에도 불구하고 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 한 가지 이유는 방사선 요법과 화학 요법이 매우 침습적 인 기술이며 치료 혜택을 제한 할 수 있기 때문입니다. 덜 침습적인 기술인 세포 또는 분자 표적 치료는 증가된 주의를 받고 있습니다. 광면역요법은 면역요법과 광선요법을 결합하여 치료 효과를 시너지효과를 향상시키는 치료 방법입니다. 면역 요법은 종양 미세 환경의 면역원성을 증가시키고 면역 조절 억제를 감소시켜 종양 면역력을 향상시켜 신체에서 종양이 파괴됩니다. 광요법은 광광원과 광선의 조합으로 1차 종양을 파괴하고, 종양 세포에서 방출되는 종양 특이적 항원들은 종양 면역력을 향상시킵니다. 종양은 표적 세포에 대해 구체적이고 선택적이기 때문에 광광합성제를 사용하여 선택적으로 치료될 수 있다. 광요법의 양면에는 광역학 치료(PDT), 광열 요법(PTT), 광화학 계 치료1이포함된다.
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 광화학계 치료와 면역요법1,2를결합한 최근 개발된 항종양 광요법 방법입니다. NIR-PIT은 근적외선 실리콘 프탈로시아닌 염료, IRdye 700DX(IR700)의 컨쥬레이션을 통해 특정 세포 표면 분자를 단일 클론 항체(mAb)로 표적화하는 분자 표적 요법이다. 표적 셀의 세포막은 NIR 광(690 nm)3로조사시 파괴된다.
기존의 광석제와 항체 또는 표적 PDT를 결합하여 표적 광요법을 사용하는 개념은3년이상4,5이다. 이전 연구는 항체에 그들을 연상시켜 기존의 PDT 에이전트를 대상으로 시도했다. 그러나, 이러한 컨쥬게이트가광세제6,7의소수성 때문에 간속에 갇혀 있었기 때문에 제한된 성공이 있었다. 더욱이, NIR-PIT의 메커니즘은 기존의 PDT와 완전히 다릅니다. 기존의 광세제는 광에너지를 흡수하고, 흥분된 상태로 탈구하고, 지면 상태로 전환하며, 아멸을 유발하는 에너지 변환으로 인한 산화 스트레스를 생성합니다. 그러나, NIR-PIT는 광화학 반응을 통해 막에 광합성제를 집합하여 세포막을 직접 파괴함으로써 급속한 괴사를 일으킨다8. NIR-PIT은 여러 가지 면에서 기존의 표적 PDT보다 우수합니다. 기존의 광세제는 낮은 소멸 계수를 가지고 있으며, 단일 항체 분자에 많은 수의 광세제부착이 필요하여 잠재적으로 결합 선호도를 감소시킵니다. 대부분의 종래의 광감제는 소수성으로, 광광전제를 면역 반응성 또는 생체 내 표적 축적을 손상시키지 않으면서 항체에 결합하는 것을 어렵게 만듭니다. 기존의 광세제는 일반적으로 가시 범위에서 빛을 흡수하여 조직 침투를 감소시킵니다.
폐암 과 악성 흉막 중피종 (MPM) 세포와 같은 내트라토라시종양을 대상으로 하는 NIR-PIT에 대한 여러 연구는9,10,11,12,13,14, 15,16,17로보고되었다. 그러나, 단지 몇몇 보고는 흉막 분비MPM 또는 폐암 모형9,10,11,12에서NIR-PIT의효험을기술했습니다. 피하 종양 이종이이식 모델은 표준 종양 모델로 생각되며 현재 새로운치료법(18)의항종양 효과를 평가하기 위해 널리 사용되고 있다. 그러나, 피하 종양 미세환경은 적절한 조직 구조또는 실제 악성표현형(19,20,21,22)을적절히 회수하는 조건의발달을허용하지 않는다. 이상적으로, 치열 교정 질병 모형은 항종양 효력의 보다 정밀한 평가를 위해 설치되어야 합니다.
여기서, 우리는 NIR-PIT를 사용하여 치료된 흉막 전파 폐암의 마우스 모델에서 효능 평가 방법을 시연한다. 흉막 보급 마우스 모델은 흉부 구멍에 종양 세포를 주입하여 생성되고 루시파제 발광을 사용하여 확인된다. 마우스는 IR700과 NIR 조사와 결합된 mAb의 정맥 주사로 가슴에 치료되었다. 치료 효과는 루시파아제 발광을 사용하여 평가하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는, MPM의 흉막 보급 모델에 대한 NIR-PIT의 치료 효과를 측정하는 방법을 시연하였다. 매우 선택적 세포 살인은 NIR-PIT로 수행되었다; 따라서, 정상 조직은 거의손상되지 않았다 23,24,25. 이러한 유형의 선택적 세포 살인으로 NIR-PIT은 보급 된 모델9,26에서</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음
Materials
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
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