Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural
Summary
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia terapéutica emergente contra el cáncer que utiliza un conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (IR700Dye) y luz NIR para destruir las células cancerosas. Aquí, presentamos un método para evaluar el efecto antitumoral de NIR-PIT en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural y mesotelioma pleural maligno utilizando imágenes de bioluminiscencia.
Abstract
La eficacia de la fotoinmunoterapia se puede evaluar con mayor precisión con un modelo de ratón ortotópico que con uno subcutáneo. Se puede utilizar un modelo de diseminación pleural para la evaluación de métodos de tratamiento para enfermedades intratorácicas como el cáncer de pulmón o el mesotelioma pleural maligno.
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia de tratamiento del cáncer desarrollada recientemente que combina la especificidad de los anticuerpos dirigidos al tumor con la toxicidad causada por un fotoabsorbente (IR700Dye) después de la exposición a la luz NIR. La eficacia de NIR-PIT se ha reportado usando varios anticuerpos; sin embargo, sólo unos pocos informes han demostrado el efecto terapéutico de esta estrategia en un modelo ortotópico. En el presente estudio, demostramos un ejemplo de evaluación de la eficacia del modelo de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT.
Introduction
El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad a pesar de décadas de investigación. Una razón es que la radioterapia y la quimioterapia son técnicas altamente invasivas, lo que puede limitar sus beneficios terapéuticos. Las terapias dirigidas celulares o moleculares, que son técnicas menos invasivas, están recibiendo una mayor atención. La fotoinmunoterapia es un método de tratamiento que mejora sinérgicamente el efecto terapéutico mediante la combinación de inmunoterapia y fototerapia. La inmunoterapia mejora la inmunidad tumoral al aumentar la inmunogenicidad del microambiente tumoral y reducir la supresión inmunorreguladora, lo que resulta en la destrucción de tumores en el cuerpo. La fototerapia destruye los tumores primarios con una combinación de fotosensibilizadores y rayos de luz, y los antígenos específicos del tumor liberados de las células tumorales mejoran la inmunidad tumoral. Los tumores se pueden tratar selectivamente con fotosensibilizadores, ya que son específicos y selectivos para las células diana. La modalidad de fototerapia incluye terapia fotodinámica (PDT), terapia fototérmica (PTT) y terapias basadas en fotoquímica1.
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es un método recientemente desarrollado de fototerapia antitumoral que combina la terapia basada en fotoquímicos y la inmunoterapia1,2. NIR-PIT es una terapia dirigida molecularmente que se dirige a moléculas específicas de la superficie celular a través de la conjugación de un colorante de ftalocianina de silicio del infrarrojo cercano, IRdye 700DX (IR700), a un anticuerpo monoclonal (mAb). La membrana celular de la célula diana se destruye tras la irradiación con luz NIR (690 nm)3.
El concepto de usar terapia de luz dirigida mediante la combinación de fotosensibilizadores y anticuerpos convencionales o PDT dirigida tiene más de tres décadas de antigüedad4,5. Estudios previos han intentado dirigirse a los agentes PDT convencionales conjudicándolos con anticuerpos. Sin embargo, hubo un éxito limitado porque estos conjugados quedaron atrapados en el hígado, debido a la hidrofobicidad de los fotosensibilizadores6,7. Además, el mecanismo de NIR-PIT es completamente diferente del de la PDT convencional. Los fotosensibilizadores convencionales generan estrés oxidativo que resulta de una conversión de energía que absorbe la energía de la luz, se disloca a un estado excitado, hace la transición al estado fundamental y causa apoptosis. Sin embargo, NIR-PIT causa necrosis rápida al destruir directamente la membrana celular al agregar fotosensibilizadores en la membrana a través de una reacción fotoquímica8. NIR-PIT es superior a la PDT dirigida convencional en muchos sentidos. Los fotosensibilidades convencionales tienen bajos coeficientes de extinción, lo que requiere la unión de un gran número de fotosensibilizadores a una sola molécula de anticuerpo, lo que podría reducir la afinidad de unión. La mayoría de los fotosensibilidades convencionales son hidrófobos, lo que dificulta la unión de los fotosensibilizadores a los anticuerpos sin comprometer su inmunorreactividad o la acumulación de dianas in vivo. Los fotosensibilizadores convencionales suelen absorber la luz en el rango visible, reduciendo la penetración del tejido.
Se han reportado varios estudios sobre NIR-PIT dirigidos a tumores intratorácicos como el cáncer de pulmón y las células del mesotelioma pleural maligno (MPM)9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Sin embargo, solo unos pocos informes han descrito la eficacia de NIR-PIT en MPM diseminada pleural o cáncer de pulmón modelos9,10,11,12. Se cree que los modelos de xenoinjerto tumoral subcutáneo son modelos tumorales estándar y actualmente se utilizan ampliamente para evaluar los efectos antitumorales de las nuevas terapias18. Sin embargo, el microambiente tumoral subcutáneo no es permisivo para el desarrollo de una estructura tisular adecuada o una condición que recapitula adecuadamente un verdadero fenotipo maligno19,20,21,22. Idealmente, se deben establecer modelos de enfermedades ortotópicas para una evaluación más precisa de los efectos antitumorales.
Aquí, demostramos un método de evaluación de la eficacia en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT. Un modelo de ratón de diseminación pleural se genera inyectando células tumorales en la cavidad torácica y se confirma utilizando luminiscencia de luciferasa. El ratón fue tratado con una inyección intravenosa de mAb conjugada con IR700 e irradiación NIR al tórax. El efecto terapéutico se evaluó mediante luminiscencia de luciferasa.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, demostramos un método para medir el efecto terapéutico de NIR-PIT en el modelo de diseminación pleural de MPM. La muerte celular altamente selectiva se realizó con NIR-PIT; así, el tejido normal apenas se dañó23,24,25. Con este tipo de muerte celular selectiva, se demostró que NIR-PIT es seguro en los modelos diseminados9,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno
Materials
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
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