胸膜普及のマウスモデルに対する近赤外光免疫療法
Summary
近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、抗体光吸収体(IR700Dye)とNIR光を利用してがん細胞を破壊する新たながん治療戦略です。ここでは、生物発光イメージングを用いた胸膜播種肺癌および悪性胸膜中皮腫のマウスモデルにおけるNIR-PITの抗腫瘍効果を評価する方法を提示する。
Abstract
光線免疫療法の有効性は、皮下マウスモデルよりも正交性マウスモデルでより正確に評価することができる。胸膜普及モデルは、肺がんや悪性胸膜中皮腫などの胸部内疾患の治療方法の評価に使用できます。
近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、NIR光への曝露後に光吸収体(IR700Dye)によって引き起こされる毒性と腫瘍標的性抗体の特異性を組み合わせた、最近開発されたがん治療戦略です。NIR-PITの有効性は、様々な抗体を使用して報告されています;しかし、この戦略の治療効果を正交性モデルで示した報告はごくわずかである。本研究では、NIR-PITを用いて治療した胸膜播種肺癌モデルの有効性評価の例を示す。
Introduction
がんは、何十年もの研究にもかかわらず、死亡率の主要な原因の1つです。その理由の一つは、放射線療法と化学療法が非常に侵襲的な技術であり、治療上の利点を制限する可能性があるということです。侵襲性の低い技術である細胞または分子標的療法は注目を集めています。光線免疫療法は、免疫療法と光線療法を組み合わせることで、治療効果を相乗的に高める治療法です。免疫療法は、腫瘍微小環境の免疫原性を高め、免疫調節抑制を低減することによって腫瘍免疫を高め、体内の腫瘍の破壊をもたらす。光線療法は、光増感剤と光線の組み合わせで原発性腫瘍を破壊し、腫瘍細胞から放出される腫瘍特異的抗原は腫瘍免疫を増強する。腫瘍は、標的細胞に特異的かつ選択的であるほど、感知剤を用いて選択的に治療することができる。光線療法のモダリティには、光力学療法(PDT)、光熱療法(PTT)、光化学ベースの治療法1が含まれる。
近赤外光免疫療法(NIR-PIT)は、光化学系療法と免疫療法1,2を組み合わせた最近開発された抗腫瘍光線療法の方法である。NIR-PITは、近赤外シリコンフタロシアニン色素IRdye 700DX(IR700)をモノクローナル抗体(mAb)に結合させることにより、特定の細胞表面分子を標的とする分子標的療法です。標的細胞の細胞膜は、NIR光(690nm)3で照射すると破壊される。
従来の光化素子と抗体または標的PDTを組み合わせることによって標的光療法を使用するという概念は、30年以上前の4,5です。これまでの研究では、それらを抗体に結合させることによって、従来のPDT剤を標的にすることを試みてきた。しかし、これらのコンジュゲートは、フォトエンサイザー6、7の疎水性のために肝臓に閉じ込められたため、限られた成功がありました。また、NIR-PITのメカニズムは、従来のPDTとは全く異なります。従来の光化剤は、光エネルギーを吸収し、励起状態に脱臼し、地盤状態に移行し、アポトーシスを引き起こすエネルギー変換から生じる酸化ストレスを生成します。しかし、NIR-PITは光化学反応8を通じて膜上の光増感剤を凝集させることによって細胞膜を直接破壊することによって急速な壊死を引き起こす。NIR-PITは、多くの点で従来のターゲットPDTよりも優れています。従来の光増感剤は、低い消光係数を有し、単一の抗体分子に多数の光増感剤を付着させる必要があり、結合親和性を低下させる可能性がある。ほとんどの従来の感知剤は疎水性であり、免疫反応性や生体内標的蓄積を損なうことなく、抗体に対して感知剤を結合することは困難です。従来の光化剤は、通常、可視範囲で光を吸収し、組織の浸透を減少させる。
肺がんや悪性胸膜中皮腫(MPM)細胞などの胸部腫瘍を標的とするNIR-PITに関するいくつかの研究が報告されている9,10,11,12,13,14,15,16,17.しかし、胸膜普及MPMまたは肺癌モデル9、10、11、12におけるNIR-PITの有効性を説明した報告はごくわずかである。皮下腫瘍異種移植モデルは、標準的な腫瘍モデルであると考えられるが、現在、新しい治療法18の抗腫瘍効果を評価するために広く使用されている。しかしながら、皮下腫瘍微小環境は、真悪性表現型19、20、21、22を適切に再現する適切な組織構造や状態の発達に対して寛容ではない。理想的には、直交性疾患モデルは、抗腫瘍効果のより正確な評価のために確立されるべきである。
ここでは、NIR-PITを用いて治療した胸膜播種肺癌のマウスモデルにおける有効性評価の方法を示す。胸膜流布マウスモデルは、胸腔に腫瘍細胞を注入することによって生成され、ルシファーゼ発光を用いて確認される。マウスを、胸部へのIR700およびNIR照射と共役したmAbの静脈内注射で治療した。治療効果を、ルシファーゼ発光を用いて評価した。
Protocol
すべてのin vivo実験は、名古屋大学動物の世話と使用委員会の実験動物資源のケアと使用のためのガイド(承認#2017-29438、#2018-30096、#2019-31234、#2020-20104)に従って行われました。名古屋大学動物センターで、生後6週間のホモ接合性腺腺ヌードマウスを購入・維持した。マウスで処置を行う場合、イオブルラン(導入:4-5%、メンテナンス2-3%)で麻酔を行った。足は麻酔の深さを確認するために?…
Representative Results
抗ポドプラニン抗体NZ-1をIR700と共役にして、NZ-1-IR700を生成した。SDS-PAGEでNZ-1とIR700の結合を確認した(図8)。ルシファーゼ発現H2373(H2373-luc)は、ルシファーゼ遺伝子10で悪性中皮腫細胞(H2373)をトランスフェクトすることにより調製した。 生後8~12週齢の雌ホモ接合性腺腺ヌードマウスを麻酔し、1×105 H2373-luc細胞を胸腔に注入し…
Discussion
本研究では、MPMの胸膜普及モデルに対するNIR-PITの治療効果を測定する方法を実証した。非常に選択的な細胞の殺しはNIR-PITで行われた;したがって、正常組織はほとんど損傷を受けていなかった23,24,25.この種の選択的細胞殺死により、NIR-PITは普及したモデル9,26<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ
Materials
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
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Cite This Article
Yasui, H., Nishinaga, Y., Taki, S., Takahashi, K., Isobe, Y., Sato, K. Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination. J. Vis. Exp. (168), e61593, doi:10.3791/61593 (2021).