Fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso per modelli murini di disseminazione pleurica
Summary
La fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT) è una strategia terapeutica emergente per il cancro che utilizza un coniugato anticorpo-fotoassorbitore (IR700Dye) e la luce NIR per distruggere le cellule tumorali. Qui, presentiamo un metodo per valutare l’effetto antitumorale di NIR-PIT in un modello murino di carcinoma polmonare disseminato pleurico e mesotelioma pleurico maligno utilizzando l’imaging a bioluminescenza.
Abstract
L’efficacia della fotoimmunoterapia può essere valutata più accuratamente con un modello murino ortotopico che con uno sottocutaneo. Un modello di disseminazione pleurica può essere utilizzato per la valutazione dei metodi di trattamento per le malattie intratoraciche come il cancro del polmone o il mesotelioma pleurico maligno.
La fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT) è una strategia di trattamento del cancro sviluppata di recente che combina la specificità degli anticorpi mirati al tumore con la tossicità causata da un fotoassorbitore (IR700Dye) dopo l’esposizione alla luce NIR. L’efficacia di NIR-PIT è stata riportata utilizzando vari anticorpi; tuttavia, solo pochi rapporti hanno mostrato l’effetto terapeutico di questa strategia in un modello ortotopico. Nel presente studio, dimostriamo un esempio di valutazione dell’efficacia del modello di carcinoma polmonare disseminato pleurico, che è stato trattato con NIR-PIT.
Introduction
Il cancro rimane una delle principali cause di mortalità nonostante decenni di ricerca. Uno dei motivi è che la radioterapia e la chemioterapia sono tecniche altamente invasive, che possono limitare i loro benefici terapeutici. Le terapie a bersaglio cellulare o molecolare, che sono tecniche meno invasive, stanno ricevendo maggiore attenzione. La fotoimmunoterapia è un metodo di trattamento che potenzia sinergicamente l’effetto terapeutico combinando immunoterapia e fototerapia. L’immunoterapia migliora l’immunità tumorale aumentando l’immunogenicità del microambiente tumorale e riducendo la soppressione immunoregolatoria, con conseguente distruzione dei tumori nel corpo. La fototerapia distrugge i tumori primari con una combinazione di fotosensibilizzanti e raggi luminosi e antigeni specifici del tumore rilasciati dalle cellule tumorali migliorano l’immunità tumorale. I tumori possono essere trattati selettivamente utilizzando fotosensibilizzatori in quanto sono specifici e selettivi per le cellule bersaglio. La modalità della fototerapia comprende la terapia fotodinamica (PDT), la terapia fototermica (PTT) e le terapie basate sulla fotochimica1.
La fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT) è un metodo recentemente sviluppato di fototerapia antitumorale che combina la terapia fotochimica e l’immunoterapia1,2. NIR-PIT è una terapia a bersaglio molecolare che prende di mira specifiche molecole di superficie cellulare attraverso la coniugazione di un colorante di ftaloccianina di silicio nel vicino infrarosso, IRdye 700DX (IR700), a un anticorpo monoclonale (mAb). La membrana cellulare della cellula bersaglio viene distrutta dopo irradiazione con luce NIR (690 nm)3.
Il concetto di utilizzare la terapia della luce mirata combinando fotosensibilizzatori convenzionali e anticorpi o PDT mirata ha più di tre decenni4,5. Studi precedenti hanno tentato di colpire gli agenti PDT convenzionali coniugandoli agli anticorpi. Tuttavia, c’è stato un successo limitato perché questi coniugati sono rimasti intrappolati nel fegato, a causa dell’idrofobicità dei fotosensibilizzatori6,7. Inoltre, il meccanismo di NIR-PIT è completamente diverso da quello del PDT convenzionale. I fotosensibilizzatori convenzionali generano stress ossidativo che deriva da una conversione di energia che assorbe l’energia luminosa, si disloca in uno stato eccitato, passa allo stato suolo e provoca apoptosi. Tuttavia, NIR-PIT provoca una rapida necrosi distruggendo direttamente la membrana cellulare aggregando fotosensibilizzatori sulla membrana attraverso una reazione fotochimica8. NIR-PIT è superiore al PDT mirato convenzionale in molti modi. I fotosensibilizzatori convenzionali hanno bassi coefficienti di estinzione, che richiedono l’attaccamento di un gran numero di fotosensibilizzatori a una singola molecola anticorpale, riducendo potenzialmente l’affinità di legame. La maggior parte dei fotosensibilizzatori convenzionali sono idrofobi, rendendo difficile legare i fotosensibilizzatori agli anticorpi senza compromettere la loro immunoreattività o l’accumulo di bersagli in vivo. I fotosensibilizzatori convenzionali in genere assorbono la luce nell’intervallo visibile, riducendo la penetrazione dei tessuti.
Diversi studi su NIR-PIT mirati a tumori intratoracici come il cancro del polmone e le cellule maligne del mesotelioma pleurico (MPM) sono stati riportati9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Tuttavia, solo pochi rapporti hanno descritto l’efficacia di NIR-PIT nel MPM pleurico disseminato o nei modelli di cancro del polmone9,10,11,12. Si ritiene che i modelli di xenotrapianto tumorale sottocutaneo siano modelli tumorali standard e sono attualmente ampiamente utilizzati per valutare gli effetti antitumorali delle nuove terapie18. Tuttavia, il microambiente tumorale sottocutaneo non è permissivo per lo sviluppo di una struttura tissutale appropriata o di una condizione che ricapitola correttamente un vero fenotipo maligno19,20,21,22. Idealmente, dovrebbero essere stabiliti modelli di malattia ortotopica per una valutazione più precisa degli effetti antitumorali.
Qui, dimostriamo un metodo di valutazione dell’efficacia in un modello murino di carcinoma polmonare disseminato pleurico, che è stato trattato con NIR-PIT. Un modello murino di disseminazione pleurica viene generato iniettando cellule tumorali nella cavità toracica e confermato utilizzando la luminescenza della luciferasi. Il topo è stato trattato con un’iniezione endovenosa di mAb coniugata con irradiazione IR700 e NIR al torace. L’effetto terapeutico è stato valutato utilizzando la luminescenza della luciferasi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per misurare l’effetto terapeutico di NIR-PIT sul modello di disseminazione pleurica del MPM. L’uccisione cellulare altamente selettiva è stata eseguita con NIR-PIT; quindi, il tessuto normale è stato appena danneggiato23,24,25. Con questo tipo di uccisione selettiva delle cellule, NIR-PIT ha dimostrato di essere sicuro nei modelli disseminati<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno
Materials
| 0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 209-016941 | for cell culture |
| 1mL syringe | TERUMO | SS-01T | for mice experiment |
| 30G needle | Nipro | 1907613 | for mice experiment |
| BALB/cSlc-nu/nu | Japan SLC | ||
| Collidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | use for gel protein staining |
| Coomassie (bradford) Plus protein assay | Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) | PI-23200 | for measuring the APC concentration |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Wako | 043-07216 | use for conjugation of IR700 |
| D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | for bioluminescence imaging and DLIT |
| GraphPad Prism7 | GraphPad software | for statistical analysis | |
| Image Studio | Li-Cor Biosciences | for analyzing 700 nm fluorescent image | |
| IRDye 700DX Ester Infrared Dye | LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) | 929-70011 | |
| isoflurane | Wako | 095-06573 | for mice anesthesia |
| IVIS Spectrum CT | PerkinElmer | for capturing bioluminescent image and DLIT | |
| Living Image | PerkinElmer | for analyzing bioluminescent image and DLIT | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) | S9763 | use for conjugation of IR700 |
| NIR Laser | Changchun New Industries Optoelectronics Technology | MRL-III-690R | for NIR irradiation |
| Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well | Invitrogen | XP04202BOX | use for SDS-PAGE |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (x4) | Invitrogen | NP0007 | use for SDS-PAGE |
| Optical power meter | Thorlabs (Newton, NJ, USA) | PM100 | for measuring the output of the NIR laser |
| PBS(-) | Wako | 166-23555 | |
| Pearl Trilogy imaging system | Li-Cor Biosciences | for capturing 700 nm fluorecent image | |
| Penicilin-Streptomycin Solution (x100) | Wako | 168-23191 | for cell culture |
| Puromycin Dihydrochloride | ThermoFisher | A1113803 | for luciferase transfection |
| RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles | PerkinElmer | CLS960002 | for luciferase transfection |
| RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red | Wako | 189-02025 | for cell culture |
| Sephadex G25 column (PD-10) | GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) | 17-0851-01 | use for conjugation of IR700 |
| UV-1900i | Shimadzu | for measuring the APC concentration |
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