FLIM-FRET Målinger af protein-protein interaktioner i levende bakterier.
Summary
Vi beskriver her en protokol til at karakterisere protein-protein interaktioner mellem to meget forskelligt udtrykt proteiner i levende Pseudomonas aeruginosa ved hjælp af FLIM-FRET målinger. Protokollen omfatter bakterier stamme konstruktioner, bakterier immobilisering, billeddannelse og post-imaging dataanalyse rutiner.
Abstract
Proteinproteininteraktioner (PPI) styrer forskellige nøgleprocesser i celler. Fluorescens livslang billeddannelse mikroskopi (FLIM) kombineret med Förster resonans energioverførsel (FRET) giver præcise oplysninger om PPI i levende celler. FLIM-FRET er afhængig af at måle fluorescens levetid henfald af en FRET donor på hver pixel i FLIM billedet, giver kvantitative og præcise oplysninger om PPI og deres rumlige cellulære organisationer. Vi foreslår her en detaljeret protokol for FLIM-FRET målinger, som vi har anvendt til at overvåge PPI i levende Pseudomonas aeruginosa i det særlige tilfælde af to interagerende proteiner udtrykt med meget forskellige kopinumre for at demonstrere kvaliteten og robustheden af teknikken til at afsløre kritiske træk ved PPI. Denne protokol beskriver i detaljer alle de nødvendige trin til PPI karakterisering – startende fra bakteriel mutant konstruktioner op til den endelige analyse ved hjælp af nyligt udviklede værktøjer, der giver avancerede visualisering muligheder for en enkel fortolkning af komplekse FLIM-FRET data.
Introduction
Proteinproteininteraktioner (PPI) styrer forskellige nøgleprocesser i celler1. PPI’ernes roller varierer afhængigt af proteinsammensætning, tilhørsforholdsfunktioner og placeringer i celler2. PPI kan undersøges ved hjælp af forskellige teknikker3. For eksempel er co-immunoprecipitation en forholdsvis enkel, robust og billig teknik, der almindeligvis anvendes værktøj til at identificere eller bekræfte PPI. Det kan dog være en udfordring at studere PPI, når de interagerende proteiner har lave udtryksniveauer, eller når interaktionerne kun er forbigående eller kun relevante i specifikke miljøer. Undersøgelse af PPI mellem de forskellige enzymer på pyoverdinvejen i P. aeruginosa kræver,at undertrykkelsen af den generelle jern-co-factored repressor Fur er lettet over at tillade ekspression af alle proteiner fra pyoverdinvejen, der skal udtrykkes i celle4,5,6. Denne fælles forordning for alle proteiner i vejen resulterer i rettidige udtryk i cellen forventes at fremme deres interaktioner. Mangfoldigheden med hensyn til størrelse, natur, udtryksniveauer og antallet af proteiner i denne metaboliske vej gør det vanskeligt at studere i rekonstituerede systemer6. Udforskning af PPI i deres cellulære miljø er derfor afgørende for yderligere at forstå de biologiske funktioner af proteiner i deres oprindelige sammenhæng.
Kun få metoder, herunder fluorescens, gør det muligt at udforske PPI i levende celler7. Blandt de forskellige fluorescens parametre, der kan måles, fluorescens levetid (dvs. den gennemsnitlige tid en fluorophore forbliver i sin ophidset tilstand, før udsender en foton) er sandsynligvis en af de mest interessante parametre at udforske i levende celler. Fluorescenslevetid for en fluorfil er meget følsom over for omgivelserne, og FLIM kan derfor give kemiske eller fysiske oplysninger om fluorophoreomgivelserne 8. Dette omfatter tilstedeværelsen af Förster resonans energioverførsel (FRET), der kan forekomme i nærværelse af en “acceptor” af fluorescens placeret i en kort afstand af en fluorescens “donor”. Energioverførsel resulterer i en betydelig afkortning af donorfluorescenslevetid(figur 1A),hvilket gør Fluorescens Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) til en effektiv tilgang til at udforske proteinproteininteraktioner direkte i levende celler. FLIM kan desuden give rumlige oplysninger om , hvor interaktionerne finder sted icellerne 7,8. Denne tilgang er yderst stærk til at undersøge PPI i situationer, hvor mærkning med fluorophores af de to interagerende partnere er mulig.
For at FRET kan forekomme – skal der være kritiske forhold på afstanden mellem to fluorophores8,9. De to fluorophores bør ikke være fjernt fra hinanden med mere end 10 nm. Derfor skal der udvises forsigtighed ved udformningen af FLIM-FRET-forsøg for at sikre, at donoren og acceptoren af fluorescens har en chance for at blive placeret tæt på hinanden i det interagerende kompleks. Selv om dette kan synes begrænsende, er det faktisk en sand fordel, da frets afstande sikrer, at to mærkede proteiner, der gennemgår FRET, skal interagere fysisk (figur 1A). Vanskelighederne med at få klare svar om PPI i colocalization eksperimenter (to colocalized proteiner kan ikke nødvendigvis interagere) er derfor ikke et problem ved hjælp af FLIM-FRET.
Figur 1: FLIM-FRET-analyseprincip . Hver pixel i det flerdimensionale FLIM-FRET-billede indeholder oplysninger om fluorescens henfald registreret på dette bestemte sted (#counts = antal registrerede fotoner i kanalen t). (A)Den klassiske repræsentation af FLIM billedet er normalt en falsk farve levetid kodet 2D-billede (venstre). Et fald i donorens gennemsnitlige fluorescenslevetid – som det ses af en ændring i farveskalaen – kan observeres i nærværelse af FRET og er informativ om tilstedeværelsen af PPI i dette rumlige område. B)Overlapningmellem donoremissionsspektret og acceptorabsorptionsspektret er nødvendig for, at FRET kan forekomme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Et andet krav til FRET er, at donorens emissionsspektrum og acceptorens absorptionsspektre skal overlappe8 (figur 1B). Den fluorescens excitation af donor bør være på bølgelængder, der bidrager meget lidt til den direkte fluorescens excitation af acceptoren. Ikke alle kombinationer af fluorophores er mulige, og vi anbefaler desuden at fortrinsvis bruge donorer med monoexponential fluorescens henfalder for at lette FLIM-FRET fortolkninger10. Flere par fluorescens proteiner opfylder disse krav, herunder den populære eGFP-mCherry par11 (for en gennemgang af paletten af tilgængelige fluorescerende protein FRET par se12,13).
FLIM-FRET gør det muligt at måle fluorescenslevetids henfaldet for en FRET-donor ved hver pixel i et FLIM-billede (Figur 1A). Der er to vigtige teknikker til at bestemme fluorescens levetid, der adskiller sig i erhvervelse og analyse: frekvens-domæne (FD)14 og tid-domæne (TD). TD FLIM er mere udbredt og udføres ved hjælp af en pulserende belysning kombineret med forskellige mulige detektionskonfigurationer, herunder gating metoder15, streak kamera16 eller tid-korreleret enkelt foton tælling (TCSPC) teknikker8. For både FD- og TD-teknikker måles fluorescenslevetid ikke direkte, men kræver en analyse af de målte data for at vurdere levetiden eller resultaterne af interaktioner. For TCSPC-teknikker er den mest udbredte analyse afhængig af at montere henfald med enkelte eller multiponentielle funktioner ved hjælp af mindst firkantede iterative re-convolutions, der minimerer den vægtede sum af resterne.
Endelig kan FLIM-FRET udføres både ved hjælp af enkelt foton eller multiphoton excitationer. Den seneste har flere fordele som at reducere autofluorescens og fotoskader ud af brændplanet. Multiphoton excitationer tillader også en længere excitation dybde, hvis der arbejdes i tykke 3D-prøver8. Tværtimod, enkelt foton excitation er normalt mere effektiv som de to-foton absorption tværsnit af fluorescerende proteiner er begrænset17.
Her foreslår vi en protokol for FLIM-FRET-målinger af PPI i levende P. aeruginosa i det særlige tilfælde af to interagerende proteiner (PvdA og PvdL) udtrykt med meget forskellige antal kopier for at demonstrere kvaliteten og robustheden af teknikken til at afsløre kritiske egenskaber ved PPI. PvdA og PvdL proteiner er involveret i pyoverdine biosyntese. PvdA er en L-ornithin N5-oxygenase og syntetiserer L-N5-formyl-N5-hydroxyornithin fra L-ornithin ved hydroxyylation (PvdA) og formylation (PvdF)18. PvdL er et ikke-ribosomal peptidsyntese (NRPS) enzym, der består af fire moduler. Det første modul katalyserer acylation af myristisk syre. Det andet modul katalyser aktivering af L-Glu og dens kondens til myristiske-coA. Derefter kondenserer det tredje modul en L-Tyr aminosyre, der derefter isomerized i D-Tyr. Endelig det fjerde modul binder en L-Dab (Diaminobutyric syre) aminosyre til at danne acylated tripeptid L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL er således ansvarlig for syntesen af de tre første aminosyrer i pyoverdinprækursoren. Samspillet mellem PvdA-protein og PvdL er overraskende, da PvdL, i modsætning til PvdI og PvdJ, ikke har et modul, der er specifikt for L-N5-formyl-N5-hydroxyornithin. Denne interaktion tyder på , at alle de enzymer , der er ansvarlige for pyoverdine-prækursorbiosyntesen , er arrangeret i store forbigående og dynamiske multienzymatiskekomplekser 19,20.
I denne rapport forklarer vi i detaljer, hvordan man konstruerer de bakteriestammer, der udtrykker de to interagerende eGFP og mCherry mærkede proteiner. Vi beskriver også prøveforberedelse og betingelser for effektiv FLIM-FRET cellebilleddannelse. Endelig foreslår vi en trin-for-trin tutorial til billedanalyse, herunder et nyligt udviklet værktøj, der giver avancerede visualiseringsmuligheder for enkel fortolkning af komplekse FLIM-FRET data. Med denne betænkning vil vi gerne overbevise ikke blot eventyrlystne, men de fleste biologer om, at FRET-FLIM er en tilgængelig og kraftfuld teknik, der er i stand til at behandle deres spørgsmål om PPI direkte i det oprindelige cellemiljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
FLIM-FRET giver nogle vigtige fordele i forhold til intensitetsbaseret FRET-billedbehandling. Fluorescens levetid er en iboende parameter af fluorophore. Som følge heraf er det ikke afhængig af lokale koncentrationer af fluorofre hverken af intensiteten af lys excitation. Fluorescens levetid er desuden også dårligt påvirket af foto-blegning. Det er især interessant at dokumentere PPI i celler, hvor lokale proteiner koncentrationer kan være meget heterogene i hele de subcellulære rum eller regioner. FLIM-FRET er o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Dr. Ludovic Richert for hans værdifulde hjælp til FLIM dataindsamling og for den tekniske vedligeholdelse og udvikling af FLIM setup. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN finansieres af Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906). YM er taknemmelig for Institut Universitaire de France (IUF) for støtte og give ekstra tid til at være dedikeret til forskning. IJS og JG anerkender Instituttet for Levering af Narkotika i Strasbourg for dets finansielle støtte.
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
- Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
- Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
- Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
- Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
- Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
- Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
- Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -. C., Masse, M. -. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
- Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
- Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
- Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
- Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
- Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated ‘siderosome’. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
- Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
- Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
- Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
- Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
- El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
- Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
- Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
- Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
- Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
- Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
- Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
- Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
- Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, (2013).
- Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
- Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing – deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
- Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
- Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings – International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).
