लाइव बैक्टीरिया में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के FLIM-FRET माप।
Summary
हम यहां FLIM-FRET माप का उपयोग कर लाइव स्यूडोमोनास एरुगिनोसा में दो अत्यधिक अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन के बीच प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की विशेषता के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल बैक्टीरिया तनाव निर्माण, बैक्टीरिया स्थिरीकरण, इमेजिंग और पोस्ट इमेजिंग डेटा विश्लेषण दिनचर्या भी शामिल है ।
Abstract
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) कोशिकाओं में विभिन्न प्रमुख प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं। फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) के साथ संयुक्त लाइव कोशिकाओं में PPIs के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करते हैं । FLIM-FRET FLIM छवि के प्रत्येक पिक्सेल पर एक FRET दाता के फ्लोरेसेंस आजीवन क्षय को मापने पर निर्भर करता है, पीपीआई और उनके स्थानिक सेलुलर संगठनों के बारे में मात्रात्मक और सटीक जानकारी प्रदान करते हैं । हम यहां FLIM-FRET माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं जिसे हमने पीपीआई की महत्वपूर्ण विशेषताओं का खुलासा करने के लिए तकनीक की गुणवत्ता और मजबूती को प्रदर्शित करने के लिए अत्यधिक अलग कॉपी नंबरों के साथ व्यक्त किए गए दो इंटरैक्टिंग प्रोटीन के विशेष मामले में लाइव स्यूडोमोनास एरुगिनोसा में पीपीआई की निगरानी के लिए आवेदन किया। यह प्रोटोकॉल पीपीआई लक्षण वर्णन के लिए सभी आवश्यक चरणों का विस्तार से वर्णन करता है – हाल ही में विकसित उपकरणों का उपयोग करके अंतिम विश्लेषण तक बैक्टीरियल उत्परिवर्ती निर्माणों से शुरू होना जटिल फ्लिम-एफआरटी डेटा की सीधी व्याख्या के लिए उन्नत दृश्य संभावनाएं प्रदान करता है।
Introduction
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) कोशिकाओं में विभिन्न प्रमुख प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है1. पीपीआई की भूमिकाएं प्रोटीन संरचना, समानता कार्यों और कोशिकाओं में स्थानों के आधार पर भिन्न होती हैं2। पीपीआई की जांच विभिन्न तकनीकों के माध्यम से की जा सकती है3। उदाहरण के लिए, सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन पीपीआई की पहचान या पुष्टि करने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले उपकरण अपेक्षाकृत सरल, मजबूत और सस्ती तकनीक है। हालांकि, पीपीआई का अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब बातचीत करने वाले प्रोटीन में कम अभिव्यक्ति का स्तर होता है या जब बातचीत केवल विशिष्ट वातावरण में क्षणिक या प्रासंगिक होती है। पी एरुगिनोसा में पाइवरडीन मार्ग के विभिन्न एंजाइमों के बीच होने वाले पीपीआई का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है कि सामान्य लोहे के सह-कारकों वाले दमन फर के दमन से राहत मिलती है ताकि पाइओवरडीन मार्ग के सभी प्रोटीनों की अभिव्यक्ति को सेल4,5, 6में व्यक्त किया जा सके। मार्ग के सभी प्रोटीन के लिए यह आम विनियमन उनकी बातचीत को बढ़ावा देने की उम्मीद सेल में समय पर अभिव्यक्ति में परिणाम है। आकार, प्रकृति, अभिव्यक्ति के स्तर और इस मेटाबॉलिक मार्ग के प्रोटीन की संख्या के शब्द में विविधता पुनर्गठित प्रणालियों में अध्ययन के लिए मुश्किल बना6। इसलिए अपने सेलुलर वातावरण में पीपीआई की खोज उनके मूल संदर्भ में प्रोटीन के जैविक कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
फ्लोरेसेंस सहित केवल कुछ ही तरीके जीवित कोशिकाओं में पीपीआई की खोज की अनुमति देते हैं7. विभिन्न फ्लोरेसेंस मापदंडों के बीच जिन्हें मापा जा सकता है, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (यानी, एक फोटॉन उत्सर्जित करने से पहले एक फ्लोरोफोर औसत समय अपने उत्साहित राज्य में रहता है) जीवित कोशिकाओं में पता लगाने के लिए सबसे दिलचस्प मापदंडों में से एक होने की संभावना है। फ्लोरोफोर का फ्लोरेसेस जीवनकाल इसके पर्यावरण के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होता है और इसलिए फ्लॉफोर परिवेश के बारे में फ्लॉवरोफोर परिवेशकेबारे में रासायनिक या भौतिक जानकारी प्रदान कर सकता है । इसमें फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफईआरटी) की उपस्थिति शामिल है जो फ्लोरेसेंस की एक “स्वीकार्यता” की उपस्थिति में हो सकती है जो फ्लोरेसेंस “दाता” की थोड़ी दूरी पर स्थित है। ऊर्जा हस्तांतरण दाता फ्लोरेसेंस लाइफटाइम(चित्रा 1A)के महत्वपूर्ण छोटा में परिणाम है, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रोटीन प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए सीधे जीवित कोशिकाओं में बना । फ्लिम इसके अतिरिक्त स्थानिक जानकारी प्रदान कर सकता है कि कोशिकाओं में बातचीत कहां होती है7,8. यह दृष्टिकोण उन स्थितियों में पीपीआई की जांच के लिए बेहद शक्तिशाली है जहां दो बातचीत करने वाले भागीदारों के फ्लोरोफोरस के साथ लेबलिंग संभव है।
FRET होने के लिए – दो फ्लोरोफोरस के बीच की दूरी पर महत्वपूर्ण स्थितियों की आवश्यकता8,9है। दो फ्लोरोफोरस को 10 एनएम से अधिक एक-दूसरे से दूर नहीं होना चाहिए। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए FLIM-FRET प्रयोगों को डिजाइन करते समय चेतावनी दी जानी चाहिए कि दाता और फ्लोरेसेंस के स्वीकारकर्ता को बातचीत परिसर में एक दूसरे के करीब स्थित होने का मौका मिले। हालांकि यह विवश लग सकता है, यह वास्तव में एक सच्चा लाभ है क्योंकि FRET की दूरी-निर्भरता यह सुनिश्चित करती है कि FRET के दौर से गुजर रहे दो लेबल वाले प्रोटीन को शारीरिक रूप से बातचीत करनी होगी(चित्रा 1A)। कोलोकैलाइजेशन प्रयोगों में पीपीआई के बारे में स्पष्ट उत्तर प्राप्त करने में कठिनाइयां (दो कोलोकैलाइज्ड प्रोटीन जरूरी बातचीत नहीं कर सकते हैं) इसलिए FLIM-FRET का उपयोग करके एक मुद्दा नहीं है।
चित्रा 1: FLIM-FRET विश्लेषण सिद्धांत। FLIM-FRET बहुआयामी छवि के प्रत्येक पिक्सेल में इस विशेष स्थान पर दर्ज फ्लोरेसेंस क्षय के बारे में जानकारी होती है (#counts = चैनल टी में पता लगाया फोटॉनों की संख्या) । (क)फ्लिम छवि का शास्त्रीय प्रतिनिधित्व आमतौर पर एक झूठी रंग लाइफटाइम इनकोडेड 2डी छवि (बाएं) होती है। दाता के मतलब फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी – जैसा कि रंग पैमाने में बदलाव से देखा जाता है – FRET की उपस्थिति में देखा जा सकता है और इस स्थानिक क्षेत्र में पीपीआई की उपस्थिति के बारे में जानकारीपूर्ण है। (ख)यूआरटी होने के लिए दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और स्वीकारकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रम के बीच ओवरलैप आवश्यक है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
FRET के लिए एक दूसरी आवश्यकता यह है कि दाता के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और स्वीकारकर्ता के अवशोषणस्पेक्ट्रा 8 (चित्रा 1B)ओवरलैप करना चाहिए । दाता की फ्लोरेसेंस उत्तेजन तरंगदैर्ध्य पर होनी चाहिए जो स्वीकारकर्ता के प्रत्यक्ष फ्लोरेसेंस उत्तेजन में बहुत कम योगदान देती है। फ्लोरोफोरेस के सभी संयोजन संभव नहीं हैं और हम इसके अतिरिक्त 2लिम-FRET व्याख्याओं10की सुविधा के लिए मोनोएक्सपोनियल फ्लोरेसेंस क्षय के साथ दानदाताओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं। फ्लोरेसेंस प्रोटीन के कई जोड़े इन आवश्यकताओं को पूरा करते हैं, जिसमें लोकप्रिय ईजीएफपी-एमएचरी कपल11 (उपलब्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन FRET जोड़े की पैलेट पर समीक्षा के लिए12,13)शामिल हैं।
FLIM-FRET एक FLIM छवि(चित्रा 1A)के हर पिक्सेल में एक FRET दाता के फ्लोरेसेंस आजीवन क्षय को मापने की अनुमति देता है । फ्लोरेसेंस लाइफटाइम निर्धारित करने के लिए दो प्रमुख तकनीकें हैं जो अधिग्रहण और विश्लेषण में भिन्न होती हैं: आवृत्ति-डोमेन(एफडी) 14 और समय-डोमेन (टीडी)। टीडी फ्लिम अधिक व्यापक है और गेटिंग विधियों15,स्ट्रीक कैमरा16 या समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन काउंटिंग (टीसीएसपीसी) तकनीकों 8 सहित विभिन्न संभावित पहचान विन्यासों के साथ संयुक्त एक स्पंदित रोशनी का उपयोग करके कियाजाताहै। एफडी और टीडी दोनों तकनीकों के लिए, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम को सीधे मापा नहीं जाता है, लेकिन जीवनभर (ओं) या बातचीत की उपस्थिति का अनुमान लगाने के लिए मापा गया डेटा के विश्लेषण की आवश्यकता होती है। टीसीएसपीसी तकनीकों के लिए, सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला विश्लेषण कम से कम वर्ग पुनरावृत्ति पुनः-convolutions का उपयोग करके एकल या बहु घातीय कार्यों के साथ क्षय को फिट करने पर निर्भर करता है जो अवशिष्टों के भारित योग को कम करता है।
अंत में, FLIM-FRET दोनों एकल फोटॉन या मल्टीफोटॉन उत्तेजन का उपयोग करके किया जा सकता है। नवीनतम में फोकल प्लेन से ऑटोफ्लोरेसेंस और फोटोडैमेज को कम करने जैसे कई फायदे हैं। मल्टीफोटोन उत्तेजन 8 मोटी 3डी नमूनों में काम करने पर भी एक लंबी उत्तेजन गहराई की अनुमतिदेताहै। इसके विपरीत, एकल फोटॉन उत्तेजन आमतौर पर अधिक कुशल होता है क्योंकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दो-फोटॉन अवशोषण क्रॉस सेक्शन17सीमित होते हैं।
यहां, हम पीपीआई की महत्वपूर्ण विशेषताओं का खुलासा करने के लिए तकनीक की गुणवत्ता और मजबूती को प्रदर्शित करने के लिए प्रतियों की अत्यधिक अलग-अलग संख्याओं के साथ व्यक्त किए गए दो इंटरैक्टिंग प्रोटीन (पीवीडीए और पीवीडीएएल) के विशेष मामले में लाइव पी. एएआरजीनोसा में पीपीआई के फ्लिम-एफपीटी मापों के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं। पीवीडीए और पीवीडीएल प्रोटीन पाइवरडीन बायोसिंथेसिस में शामिल हैं। पीवीडीए एक एल-ऑर्निथिन एन5-ऑक्सीजनेज है और एल-एन5-फॉर्माइल-एन5-हाइड्रोक्सीऑर्निथिन को एल-ऑर्निथिन से हाइड्रोक्सिलेशन (पीवीडा) और फॉर्मिलेशन (पीवीडीएफ)18से संश्लेषित करता है। पीवीडीएल एक गैर-रिबोसोमल पेप्टाइड संश्लेषण (एनआरपीएस) एंजाइम है जो चार मॉड्यूल से बना है। पहला मॉड्यूल myristic एसिड के acylation उत्प्रेरित करता है। दूसरा मॉड्यूल एल-ग्लू की सक्रियता और इसके संघनन को myristic-coA को उत्प्रेरित करता है । फिर, तीसरा मॉड्यूल एल-टायर अमीनो एसिड को संघनित करता है जिसे डी-टायर में आइसोमराइज्ड किया जाता है। अंत में, चौथा मॉड्यूल एक एल-डाब (Diaminobutyric एसिड) अमीनो एसिड बांधता है जो acylated tripeptide एल-ग्लू/डी-टायर/एल-ढाब6के रूप में । पीवीडीएल इस प्रकार पाइवरडीन अग्रदूत के तीन पहले अमीनो एसिड के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार है। पीवीडीए प्रोटीन की पीवीडीए प्रोटीन की बातचीत आश्चर्य की बात है क्योंकि पीवीडीएल, पीवीडीएआई और पीवीडीजे के विपरीत, एल-एन5-फॉर्माइल-एन5-हाइड्रोक्सीऑर्निथिन के लिए विशिष्ट मॉड्यूल नहीं ले जाता है। इस बातचीत से पता चलता है कि पाइवरडीन अग्रदूत बायोसिंथेसिस के लिए जिम्मेदार सभी एंजाइमों को बड़े क्षणिक और गतिशील बहु-एंजाइमीय परिसरों में व्यवस्थित किया जाता है19,20।
इस रिपोर्ट में हम विस्तार से बताते हैं कि मूल रूप से दो बातचीत eGFP और mCherry लेबल प्रोटीन व्यक्त जीवाणु उपभेदों का निर्माण कैसे करें । हम कुशल फ्लिम-वीआरटी सेल इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी और शर्तों का भी वर्णन करते हैं। अंत में, हम छवि विश्लेषण के लिए एक कदम-दर-कदम ट्यूटोरियल का प्रस्ताव करते हैं जिसमें हाल ही में विकसित उपकरण शामिल है जो जटिल फ्लिम-एफआरटी डेटा की सीधी व्याख्या के लिए उन्नत दृश्य संभावनाएं प्रदान करता है। इस रिपोर्ट के साथ, हम न केवल साहसी बल्कि अधिकांश जीवविज्ञानियों को यह समझाना चाहते हैं कि FRET-FLIM एक सुलभ और शक्तिशाली तकनीक है जो मूल सेलुलर वातावरण में सीधे पीपीआई के बारे में उनके सवालों का समाधान करने में सक्षम है।
Protocol
Representative Results
Discussion
FLIM-FRET तीव्रता आधारित FRET इमेजिंग पर कुछ प्रमुख लाभ प्रदान करता है। फ्लोरेसेंस लाइफटाइम फ्लोरोफोर का एक आंतरिक पैरामीटर है। नतीजतन, यह प्रकाश उत्तेजन की तीव्रता पर न तो फ्लोरोफोरस की स्थानीय सांद्रता पर ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम FLIM डेटा अधिग्रहण पर उनकी मूल्यवान सहायता के लिए और FLIM सेटअप के तकनीकी रखरखाव और विकास के लिए डॉ लुडोविक रिचर्ट को स्वीकार करते हैं। इस काम को प्रियतम डालना ला Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था । वीएन को प्रियतम डालना ला रेचेचे मेडिडेल (FRM-SPF201809006906) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। YM समर्थन के लिए संस्थान Universitaire डी फ्रांस (आईयूएफ) के लिए आभारी है और अतिरिक्त समय प्रदान करने के लिए अनुसंधान के लिए समर्पित किया जाएगा । आईजेएस और जेजी अपनी वित्तीय सहायता के लिए स्ट्रासबर्ग के ड्रग डिलिवरी पर संस्थान को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
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