使用分裂荧光素酶互补测定法展示高尔基体驻留III型膜蛋白形成的异源复合物
Summary
这里提出的方案旨在使用分裂荧光素酶互补测定的最新变体，证明高尔基体驻留的III型膜蛋白与活哺乳动物细胞中细胞质暴露的N-和/或C-末端之间异源相互作用的发生。
Abstract
该协议的目标是探索分裂荧光素酶互补的最新变体的适用性，以证明由核苷酸糖转运蛋白（NST）形成的异源复合物。这些ER和高尔基体驻留的多跨膜蛋白携带细胞质合成的核苷酸糖穿过细胞器膜，以提供介导糖基化及其底物的酶。NST以二聚体和/或更高的低聚物形式存在。不同 NST 之间的异源相互作用也有报道。为了验证该技术是否适合研究NST异色化现象，我们针对两种高尔基体驻留的NSTs的组合对其进行了测试，这两种NSTs先前已被证明可以通过其他几种方式关联。荧光素酶补体测定似乎特别适合研究高尔基体驻留膜蛋白之间的相互作用，因为它不需要高表达水平，这通常会引发蛋白质错位并增加假阳性的风险。
Introduction
本手稿描述了一种分步方案，以使用分裂荧光素酶互补测定的最新变体检查瞬时转染的人细胞中高尔基体驻留的III型膜蛋白之间是否存在异源相互作用。该程序已经针对核苷酸糖转运蛋白（NST）进行了最广泛的测试，但我们也能够获得其他高尔基体驻留的III型膜蛋白的阳性结果，其N和/或C-末端面向细胞质。
我们的研究小组探索了NST在大分子糖基化中的作用。NST是高尔基体和/或ER驻留的III型膜蛋白，其N端和C端朝向器官膜的细胞质侧1。NST被认为携带核苷酸激活的糖穿过细胞器膜，为其底物提供糖基转移酶。NST形成二聚体和/或更高的低聚物2，3，4，5，6，7，8，9，10。此外，还报道了不同NST之间的异源相互作用6，11。NST也被证明与功能相关的糖基化酶形成复合物12，13，14。我们寻求一种替代目前使用的技术，基于荧光寿命成像（FLIM）的FRET方法，用于研究NST和功能相关的高尔基体驻留蛋白的相互作用，因此我们决定测试分裂荧光素酶互补测定。它使我们能够确定NST和功能相关的糖基化酶之间的新相互作用9。
拆分荧光素酶补体测定的最新修改，NanoBiT，用于此处介绍的方案15。它依赖于从两个片段中重建荧光素酶（例如，NanoLuc） – 大的，称为大BiT或LgBiT，一种17.6 kDa蛋白，以及小的，仅由11个氨基酸组成，称为小BiT或SmBiT。感兴趣的两种蛋白质与互补片段融合，并在人类细胞系中瞬时表达。如果两种融合蛋白相互作用，则在添加细胞可渗透底物时原位产生发光。这两个片段已经过优化，因此它们与最小的亲和力结合，除非它们通过它们融合到的目标蛋白质之间的相互作用而聚集在一起。
一般来说，基于生物发光的方法比基于荧光的方法具有一些优势。生物发光信号具有更高的信噪比，因为与荧光素酶衍生的信号相比，背景发光可以忽略不计16。相比之下，基于荧光的方法通常受到由自发荧光现象引起的相对较高的背景的影响。此外，生物发光对分析细胞的危害小于荧光，因为在前一种情况下，不需要激发样品。由于这些原因，在体内研究PPI的生物发光方法优于常用的荧光方法，如Förster共振能量转移（FRET）或双分子荧光互补（BiFC）。
我们的方案依赖于将感兴趣的蛋白质组合获得的发光参考为对照组合获得的发光。后者包括一种被测试的蛋白质，它与较大的片段和对照蛋白（例如HaloTag）融合，与较小的片段融合。后者是一种细菌来源的蛋白质，预计不会与任何哺乳动物蛋白质相互作用。使用这种蛋白质作为对照会限制要分析的高尔基体驻留蛋白质对的拓扑结构。由于在哺乳动物细胞中，这种蛋白质是在细胞质中合成的，因此感兴趣的两种蛋白质都应该至少有一个细胞质尾巴。
这种方法对于PPI的初始筛选特别有用。当感兴趣的融合蛋白以不足以应用其他方法的水平表达时，它可能成为首选方法。同样，如果感兴趣的蛋白质以高水平表达，则分裂荧光素酶互补测定可能是最佳选择，但这会对其亚细胞定位产生不利影响或已知会迫使非特异性相互作用。由于较小的片段只有11个氨基酸，因此当使用较大的标签是不可能的时，可以应用分裂的荧光素酶互补测定。最后，它可以用来进一步确认使用其他技术获得的数据，如这里介绍的情况。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们提供了一个详细的方案，能够使用分裂荧光素酶互补测定法演示高尔基体驻留的III型膜蛋白（如NSTs）之间形成的异源复合物。所提出的数据分析和解释方法涉及将感兴趣的蛋白质组合获得的发光与为相应对照组合获得的发光相关联，其由与较大片段融合的目标蛋白质之一和与较小片段融合的细菌来源的控制蛋白组成。后者在哺乳动物细胞的细胞质中表达;因此，将其用作参考需要分?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了波兰克拉科夫国家科学中心（NCN）第2016/23/D/NZ3/01314号资助。
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
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