Демонстрация гетерологичных комплексов, образованных мембранными белками типа III Гольджи с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы
Summary
Представленный здесь протокол предназначен для демонстрации возникновения гетерологичных взаимодействий между мембранными белками гольджи-резидентного типа III с цитоплазматически экспонированными N- и/или C-терминами в живых клетках млекопитающих с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы.
Abstract
Целью данного протокола является изучение применимости самого последнего варианта комплементации расщепленной люциферазы для демонстрации гетерологичных комплексов, образованных нуклеотидными сахарными транспортерами (НСТ). Эти ER- и гольджи-резидентные мультитрансмембранные белки переносят цитоплазматически синтезированные нуклеотидные сахара через мембраны органелл для снабжения ферментами, которые опосредуют гликозилирование с их субстратами. НСТ существуют в виде димеров и/или более высоких олигомеров. Сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными НСТ. Чтобы проверить, подходит ли метод для изучения явления гетеромеризации NST, мы протестировали его на комбинации двух НСТ Гольджи, которые, как было ранее показано, связываются несколькими другими способами. Анализ комплементации люциферазы, по-видимому, особенно подходит для изучения взаимодействий между мембранными белками-резидентами Гольджи, поскольку он не требует высоких уровней экспрессии, которые часто вызывают неправильную локализацию белка и увеличивают риск ложных срабатываний.
Introduction
В этой рукописи описывается пошаговый протокол проверки наличия гетерологичных взаимодействий между мембранными белками типа III гольджи в транзиторно трансфектированных клетках человека с использованием самого последнего варианта анализа комплементации расщепленной люциферазы. Процедура была наиболее широко протестирована против нуклеотидных сахарных транспортеров (NST), но мы также смогли получить положительные результаты для других мембранных белков типа III, резидентные по Гольджи, чьи N- и / или C-термины обращены к цитоплазме.
Наша исследовательская группа исследует роль НСТ в гликозилировании макромолекул. NST представляют собой гольджи- и/или ER-резидентные мембранные белки типа III с N- и C-терминами, обращенными к цитоплазматической стороне органеллярной мембраны1. Считается, что NST переносят нуклеотид-активированные сахара через мембраны органелл для снабжения гликозилтрансферазами с их субстратами. НСТ образуют димеры и/или более высокие олигомеры2,3,4,5,6,7,8,9,10. Кроме того, сообщалось также о гетерологичных взаимодействиях между различными НСТ6,11. Также было продемонстрировано, что НСТ образуют комплексы с функционально родственными ферментами гликозилирования12,13,14. Мы искали альтернативу используемому в настоящее время методу, подходу FRET на основе флуоресцентной визуализации (FLIM) для изучения взаимодействий NST и функционально связанных белков-резидентов Гольджи, поэтому мы решили протестировать анализ комплементации расщепленной люциферазы. Это позволило нам идентифицировать новое взаимодействие между NST и функционально связанным ферментом гликозилирования9.
Самая последняя модификация анализа комплементации расщепленной люциферазы, NanoBiT, используется в протоколе, представленном здесь15. Он опирается на восстановление фермента люциферазы (например, NanoLuc) из двух фрагментов – большого, называемого большим BiT или LgBiT, белка 17,6 кДа, и маленького, состоящего только из 11 аминокислот, называемого малым BiT или SmBiT. Два интересующих белка сливаются с комплементарными фрагментами и временно экспрессируются в клеточной линии человека. Если два синтезированных белка взаимодействуют, люминесценция образуется in situ при добавлении клеточного проницаемого субстрата. Эти два фрагмента были оптимизированы таким образом, чтобы они ассоциировались с минимальным сродством, если они не были объединены взаимодействием между белками, представляющими интерес, с которыми они слиты.
В целом, методы, основанные на биолюминесценции, имеют некоторые преимущества перед методами, основанными на флуоресценции. Биолюминесцентные сигналы имеют более высокое отношение сигнал/шум, поскольку фоновая люминесценция незначительна по сравнению с сигналом, полученным из люциферазы16. Напротив, подходы, основанные на флуоресценции, обычно страдают от относительно высокого фона, вызванного явлением автофлуоресценции. Кроме того, биолюминесценция менее вредна для анализируемых клеток, чем флуоресценция, так как в первом случае нет необходимости возбуждать образец. По этим причинам биолюминесцентные подходы к изучению ИПП in vivo превосходят широко используемые флуоресцентные методы, такие как резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) или бимолекулярное флуоресцентное комплементирование (BiFC).
Наш протокол основан на отсылке люминесценции, полученной для комбинации белков, представляющей интерес, к люминесценции, полученной для контрольной комбинации. Последний включает в себя один из испытуемых белков, который сливается с более крупным фрагментом, и контрольный белок (например, HaloTag), слитый с меньшим фрагментом. Последний представляет собой белок бактериального происхождения, который, как ожидается, не будет взаимодействовать ни с одним из белков млекопитающих. Использование этого белка в качестве контроля создает ограничения для топологии пар белков Гольджи-резидентов, подлежащих анализу. Поскольку в клетках млекопитающих этот белок синтезируется в цитоплазме, оба интересующих белка должны иметь хотя бы один цитоплазматический хвост.
Этот подход может быть особенно полезен для первоначального скрининга ИПП. Это может стать методом выбора, когда интересующие белки слияния выражены на уровнях, которые просто недостаточны для применения других подходов. Аналогичным образом, анализ комплементации расщепленной люциферазы может быть лучшим вариантом, если интересующие белки экспрессируются на высоких уровнях, но это отрицательно влияет на их субклеточную локализацию или, как известно, вызывает неспецифические взаимодействия. Поскольку меньший фрагмент содержит только 11 аминокислот, анализ комплементации расщепленной люциферазы может быть применен при использовании более крупных меток невозможно. Наконец, он может быть использован для дальнейшего подтверждения данных, полученных с использованием других методов, как в случае, представленном здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем подробный протокол, позволяющий продемонстрировать гетерологичные комплексы, образующиеся между мембранными белками типа III Гольджи, такими как NST, с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы. Предлагаемый подход к анализу и интерпретации …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом No 2016/23/D/NZ3/01314 от Национального научного центра (NCN), Краков, Польша.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
