Golgi-Resident Tip III Membran Proteinleri tarafından oluşturulan Heterolog Komplekslerin Bölünmüş Luciferaz Komplemantasyon Testi Kullanılarak Gösterilmesi
Summary
Burada sunulan protokol, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, canlı memeli hücrelerinde sitoplazmik olarak maruz kalan N- ve / veya C-termini ile Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin oluşumunu göstermeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Bu protokolün amacı, nükleotid şeker taşıyıcıları (NST’ler) tarafından oluşturulan heterolog kompleksleri göstermek için bölünmüş lusiferaz komplemansiyonunun en son varyantının uygulanabilirliğini araştırmaktır. Bu ER ve Golgi’de yerleşik multitransmembran proteinleri, substratlarıyla glikozilasyona aracılık eden enzimleri sağlamak için sitoplazmik olarak sentezlenmiş nükleotid şekerlerini organel membranları boyunca taşır. NST’ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler olarak bulunur. Farklı NST’ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir. Tekniğin NST heteromerizasyonu fenomenini incelemek için uygun olup olmadığını doğrulamak için, daha önce birkaç başka yolla ilişkili olduğu gösterilen iki Golgi’de yerleşik NST’nin bir kombinasyonuna karşı test ettik. Lusiferaz kompleman testi, Golgi’de yerleşik membran proteinleri arasındaki etkileşimleri incelemek için özellikle uygun görünmektedir, çünkü genellikle protein yanlış lokalizasyonunu tetikleyen ve yanlış pozitif riskini artıran yüksek ekspresyon seviyeleri gerektirmez.
Introduction
Bu makalede, bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son varyantını kullanarak, geçici olarak transfekte edilmiş insan hücrelerinde Golgi’de yerleşik tip III membran proteinleri arasındaki heterolog etkileşimlerin varlığını kontrol etmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Prosedür, nükleotid şeker taşıyıcılarına (NST’ler) karşı en kapsamlı şekilde test edilmiştir, ancak N- ve / veya C-termini sitoplazmaya bakan diğer Golgi-yerleşik tip III membran proteinleri için de olumlu sonuçlar elde edebildik.
Araştırma grubumuz, NST’lerin makromoleküllerin glikozilasyonundaki rolünü araştırmaktadır. NST’ler, organellar membranın sitoplazmik tarafına bakan N- ve C-termini ile Golgi ve/veya ER’de yerleşik tip III membran proteinleridir1. NST’lerin, glikoziltransferazları substratlarıyla beslemek için nükleotid ile aktive olmuş şekerleri organel zarları boyunca taşıdığı düşünülmektedir. NST’ler dimerler ve / veya daha yüksek oligomerler oluşturur2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ayrıca, farklı NST’ler arasındaki heterolog etkileşimler de bildirilmiştir6,11. NST’lerin fonksiyonel olarak ilişkili glikozilasyon enzimleri ile kompleksler oluşturduğu da gösterilmiştir12,13,14. NST’lerin ve fonksiyonel olarak ilişkili Golgi’de yerleşik proteinlerin etkileşimlerini incelemek için günümüzde kullanılan floresan ömür boyu görüntüleme (FLIM) tabanlı FRET yaklaşımına bir alternatif aradık, bu yüzden bölünmüş lusiferaz kompleman testini test etmeye karar verdik. Bir NST ile fonksiyonel olarak ilişkili bir glikozilasyon enzimi arasındaki yeni bir etkileşimi tanımlamamızı sağladı9.
Bölünmüş lusiferaz kompleman testinin en son modifikasyonu olan NanoBiT, burada sunulan protokolde kullanılmaktadır15. Lusiferaz enziminin (örneğin, NanoLuc) iki parçadan yeniden yapılandırılmasına dayanır – büyük BiT veya LgBiT olarak adlandırılan büyük olanı, 17.6 kDa’lık bir protein ve küçük BiT veya SmBiT olarak adlandırılan sadece 11 amino asitten oluşan küçük olanı. İlgilenilen iki protein, tamamlayıcı parçalarla kaynaştırılır ve geçici olarak bir insan hücre hattında ifade edilir. İki füzyon proteini etkileşime girerse, hücre geçirgen bir substratın eklenmesiyle in situ olarak bir lüminesans üretilir. Bu iki parça, kaynaştıkları ilgili proteinler arasındaki bir etkileşimle bir araya getirilmedikleri sürece minimum afinite ile ilişkilendirilmeleri için optimize edilmiştir.
Genel olarak, biyolüminesans bazlı yöntemlerin floresan bazlı yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Biyolüminesan sinyaller daha yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahiptir, çünkü arka plan lüminesansı lusiferaz kaynaklı sinyale kıyasla ihmal edilebilir16. Buna karşılık, floresan temelli yaklaşımlar genellikle otofloresan fenomeninin neden olduğu nispeten yüksek bir arka plandan muzdariptir. Ayrıca, biyolüminesans, analiz edilen hücrelere floresandan daha az zararlıdır, çünkü eski durumda numuneyi uyarmaya gerek yoktur. Bu nedenlerden dolayı, PPI’ları in vivo olarak incelemeye yönelik biyolüminesan yaklaşımlar, Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) veya Bimoleküler Floresan Tamamlama (BiFC) gibi yaygın olarak kullanılan floresan yöntemlerden daha fazladır.
Protokolümüz, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansı, kontrol kombinasyonu için elde edilen lüminesansa yönlendirmeye dayanmaktadır. İkincisi, daha büyük bir parça ile kaynaşmış test edilen proteinlerden birini ve daha küçük bir parça ile kaynaşmış bir kontrol proteinini (örneğin, HaloTag) içerir. İkincisi, memeli proteinlerinin hiçbiriyle etkileşime girmesi beklenmeyen bakteriyel kökenli bir proteindir. Bu proteini bir kontrol olarak kullanmak, analiz edilecek Golgi’de yaşayan protein çiftlerinin topolojisinde sınırlamalar getirir. Memeli hücrelerinde bu protein sitoplazmada sentezlendiğinden, ilgilenilen her iki proteinin de en az bir sitoplazmik kuyruğu olmalıdır.
Bu yaklaşım, ÜFE’lerin ilk taraması için özellikle yararlı olabilir. İlgilenilen füzyon proteinleri, uygulanacak diğer yaklaşımlar için yetersiz olan seviyelerde ifade edildiğinde tercih edilen yöntem haline gelebilir. Benzer şekilde, bölünmüş lusiferaz kompleman testi, ilgili proteinler yüksek seviyelerde eksprese edilirse en iyi seçenek olabilir, ancak bu, hücre altı lokalizasyonlarını olumsuz yönde etkiler veya spesifik olmayan etkileşimleri zorladığı bilinmektedir. Daha küçük fragman sadece 11 amino aside sahip olduğundan, daha büyük etiketler kullanıldığında bölünmüş lusiferaz kompleman testi uygulanabilir. Son olarak, burada sunulan durumda olduğu gibi, diğer teknikler kullanılarak elde edilen verileri daha fazla doğrulamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bölünmüş lusiferaz kompleman testi kullanılarak NST’ler gibi Golgi’de yerleşik tip III membran proteinleri arasında oluşan heterolog komplekslerin gösterilmesini sağlayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Veri analizi ve yorumlanması için önerilen yaklaşım, ilgilenilen protein kombinasyonu için elde edilen lüminesansın, daha büyük parça ile kaynaşmış ilgili proteinlerden birinden ve daha küçük parça ile kaynaşmış bir bakteri kökenli kontrol proteininden oluşan karşılık gelen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Polonya’nın Krakow kentindeki Ulusal Bilim Merkezi’nden (NCN) 2016/23/D/NZ3/01314 no’lu hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
