Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida

Summary

El protocolo presentado aquí está destinado a demostrar la ocurrencia de interacciones heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi con N- y/o C-termini expuestas citoplasmáticamente en células vivas de mamíferos utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida.

Abstract

El objetivo de este protocolo es explorar la aplicabilidad de la variante más reciente de complementación de luciferasa dividida para demostrar complejos heterólogos formados por transportadores de azúcar de nucleótidos (NST). Estas proteínas multitransmembrana residentes en ER y Golgi transportan los azúcares nucleótidos sintetizados citoplasmáticamente a través de las membranas de orgánulos para suministrar enzimas que median la glicosilación con sus sustratos. Los NST existen como dímeros y/oligómeros superiores. También se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes NST. Para verificar si la técnica es adecuada para estudiar el fenómeno de heteromerización de NST, la probamos contra una combinación de los dos NST residentes en Golgi que previamente se ha demostrado que se asocian por varios otros medios. El ensayo de complementación con luciferasa parece ser particularmente adecuado para estudiar las interacciones entre las proteínas de membrana residentes en Golgi, ya que no requiere altos niveles de expresión, que a menudo desencadenan una mala localización de las proteínas y aumentan el riesgo de falsos positivos.

Introduction

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para verificar la presencia de interacciones heterólogas entre las proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi en células humanas transfectadas transitoriamente utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida. El procedimiento ha sido probado más extensamente contra transportadores de azúcar de nucleótidos (NST), pero también pudimos obtener resultados positivos para otras proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi cuyos N- y / o C-termini se enfrentan al citoplasma.

Nuestro grupo de investigación explora el papel de los NST en la glicosilación de macromoléculas. Los NST son proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi y/o ER con N- y C-termini frente al lado citoplasmático de la membrana organelástica1. Se cree que los NST transportan azúcares activados por nucleótidos a través de las membranas de orgánulos para suministrar glicosiltransferasas con sus sustratos. Los NST forman dímeros y/o oligómeros superiores2,3,4,5,6,7,8,9,10. Además, también se han reportado interacciones heterólogas entre diferentes ^NST6,11. También se demostró que los NST forman complejos con enzimas de glicosilación funcionalmente relacionadas12,13,14. Buscamos una alternativa a la técnica utilizada actualmente, el enfoque FRET basado en imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM), para estudiar las interacciones de los NST y las proteínas residentes de Golgi funcionalmente relacionadas, por lo que decidimos probar el ensayo de complementación de luciferasa dividida. Nos permitió identificar una nueva interacción entre un NST y una enzima de glicosilación funcionalmente ^relacionada9.

La modificación más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida, NanoBiT, se utiliza en el protocolo presentado ^aquí15. Se basa en la reconstitución de la enzima luciferasa (por ejemplo, NanoLuc) de los dos fragmentos: el grande, denominado como BiT grande o LgBiT, una proteína de 17,6 kDa, y el pequeño, compuesto de solo 11 aminoácidos, denominado BiT pequeño o SmBiT. Las dos proteínas de interés se fusionan con los fragmentos complementarios y se expresan transitoriamente en una línea celular humana. Si las dos proteínas de fusión interactúan, se produce una luminiscencia in situ tras la adición de un sustrato permeable a la célula. Estos dos fragmentos han sido optimizados para que se asocien con una afinidad mínima a menos que se unan mediante una interacción entre las proteínas de interés a las que se fusionan.

En general, los métodos basados en bioluminiscencia tienen algunas ventajas sobre los basados en la fluorescencia. Las señales bioluminiscentes tienen una mayor relación señal-ruido porque la luminiscencia de fondo es insignificante en comparación con la señal derivada de la ^luciferasa16. En contraste, los enfoques basados en la fluorescencia generalmente sufren de un fondo relativamente alto causado por el fenómeno de la autofluorescencia. Además, la bioluminiscencia es menos perjudicial para las células analizadas que la fluorescencia, ya que en el primer caso no hay necesidad de excitar la muestra. Por esas razones, los enfoques bioluminiscentes para estudiar los IBP in vivo superan a los métodos fluorescentes comúnmente utilizados como la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) o la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC).

Nuestro protocolo se basa en referir la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés a la luminiscencia obtenida para la combinación de control. Este último incluye la de las proteínas probadas que se fusiona con un fragmento más grande y una proteína de control (por ejemplo, HaloTag), fusionada con un fragmento más pequeño. Esta última es una proteína de origen bacteriano que no se espera que interactúe con ninguna de las proteínas de mamíferos. El uso de esta proteína como control plantea limitaciones a la topología de los pares de proteínas residentes de Golgi a analizar. Dado que en las células de mamíferos esta proteína se sintetiza en el citoplasma, ambas proteínas de interés deben tener al menos una cola citoplasmática.

Este enfoque puede ser particularmente útil para el cribado inicial de IBP. Puede convertirse en el método de elección cuando las proteínas de fusión de interés se expresan a niveles que son simplemente insuficientes para que se apliquen otros enfoques. Del mismo modo, el ensayo de complementación de luciferasa dividida puede ser la mejor opción si las proteínas de interés se expresan en niveles altos, pero esto afecta negativamente su localización subcelular o se sabe que fuerza interacciones no específicas. Dado que el fragmento más pequeño tiene solo 11 aminoácidos, el ensayo de complementación de luciferasa dividida se puede aplicar cuando el uso de etiquetas más grandes es imposible. Finalmente, se puede emplear para confirmar aún más los datos obtenidos utilizando otras técnicas, como en el caso presentado aquí.

Protocol

1. Generación de plásmidos de expresión Examinar la topología de membrana de las proteínas de interés utilizando una herramienta de predicción de topología. Diseñar la estrategia de clonación para que los fragmentos más grandes y más pequeños se enfrenten al citoplasma una vez que las proteínas de fusión se hayan insertado en las membranas de Golgi. Si, como en el caso aquí presentado, tanto N- como C-termini de las proteínas de interés están orientadas citoplasmáticamente, etiquet…

Representative Results

Para obtener los datos más fiables en este enfoque se deben probar todas las combinaciones posibles (ver Figura 1). Paralelamente, deben incluirse controles positivos y negativos. El control positivo debe consistir en las dos proteínas que se sabe que interactúan, de las cuales una está fusionada con el fragmento más grande y la otra está fusionada con el fragmento más pequeño. El control negativo idealmente debería consistir en las dos proteínas de membrana de tipo III que no inte…

Discussion

Aquí proporcionamos un protocolo detallado que permite la demostración de complejos heterólogos formados entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi, como los NST, utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida. El enfoque propuesto para el análisis e interpretación de datos implica relacionar la luminiscencia obtenida para la combinación proteica de interés con la luminiscencia obtenida para la combinación de control correspondiente, que está compuesta por una de las proteínas de…

Materials

0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler