Demonstratie van heterologe complexen gevormd door Golgi-Resident Type III membraaneiwitten met behulp van Split Luciferase Complementation Assay

Summary

Het hier gepresenteerde protocol is bedoeld om het optreden van heterologe interacties tussen Golgi-residente type III membraaneiwitten met cytoplasmatisch blootgestelde N- en/of C-termini in levende zoogdiercellen aan te tonen met behulp van de meest recente variant van de split luciferase complementatie assay.

Abstract

Het doel van dit protocol is om de toepasbaarheid te onderzoeken van de meest recente variant van split luciferase complementatie voor het aantonen van heterologe complexen gevormd door nucleotide suikertransporters (NST’s). Deze ER- en Golgi-residente multitransmembraaneiwitten dragen de cytoplasmatisch gesynthetiseerde nucleotidesuikers over organelmembranen om enzymen te leveren die glycosylering bemiddelen met hun substraten. NST’s bestaan als dimeren en/of hogere oligomeren. Heterologe interacties tussen verschillende NST’s zijn ook gemeld. Om te verifiëren of de techniek geschikt is voor het bestuderen van het fenomeen van NST-heteromerisatie, hebben we het getest tegen een combinatie van de twee Golgi-residente NST’s waarvan eerder is aangetoond dat ze op verschillende andere manieren associëren. De luciferase-complementatietest lijkt bijzonder geschikt te zijn voor het bestuderen van interacties tussen Golgi-residente membraaneiwitten, omdat het geen hoge expressieniveaus vereist, die vaak eiwitmislokalisatie veroorzaken en het risico op valse positieven verhogen.

Introduction

Dit manuscript beschrijft een stap-voor-stap protocol om te controleren op de aanwezigheid van heterologe interacties tussen Golgi-residente type III membraaneiwitten in tijdelijk getransfecteerde menselijke cellen met behulp van de meest recente variant van de split luciferase complementatie assay. De procedure is het meest uitgebreid getest tegen nucleotide suikertransporters (NST’s), maar we konden ook positieve resultaten behalen voor andere Golgi-residente type III-membraaneiwitten waarvan de N- en / of C-termini tegenover het cytoplasma staan.

Onze onderzoeksgroep onderzoekt de rol van NST’s bij glycosylering van macromoleculen. NST’s zijn Golgi- en/of ER-residente type III membraaneiwitten met N- en C-termini naar de cytoplasmatische kant van het organellaire ^membraan1. Van NST’s wordt gedacht dat ze nucleotide-geactiveerde suikers over organelmembranen dragen om glycosyltransferasen van hun substraten te voorzien. NST’s vormen dimeren en/of hogere oligomeren2,3,4,5,6,7,8,9,10. Bovendien zijn er ook heterologe interacties tussen verschillende NST’s ^gemeld6,11. NST’s bleken ook complexen te vormen met functioneel gerelateerde glycosylatie-enzymen12,13,14. We zochten naar een alternatief voor de momenteel gebruikte techniek, fluorescence lifetime imaging (FLIM)-gebaseerde FRET-benadering, voor het bestuderen van interacties van NST’s en functioneel gerelateerde Golgi-residente eiwitten, dus besloten we om de split luciferase complementatie assay te testen. Het stelde ons in staat om een nieuwe interactie te identificeren tussen een NST en een functioneel gerelateerd glycosylatie-enzym9.

De meest recente wijziging van de split luciferase complementatie assay, NanoBiT, wordt gebruikt in het protocol dat hier wordt ^{gepresenteerd15}. Het is afhankelijk van de reconstitutie van het luciferase-enzym (bijv. NanoLuc) uit de twee fragmenten – de grote, aangeduid als grote BiT of LgBiT, een 17,6 kDa-eiwit, en de kleine, samengesteld uit slechts 11 aminozuren, aangeduid als kleine BiT of SmBiT. De twee eiwitten van belang zijn versmolten met de complementaire fragmenten en tijdelijk tot expressie gebracht in een menselijke cellijn. Als de twee fusie-eiwitten op elkaar inwerken, wordt in situ een luminescentie geproduceerd na toevoeging van een celdoorlatend substraat. Deze twee fragmenten zijn geoptimaliseerd zodat ze zich associëren met minimale affiniteit, tenzij ze worden samengebracht door een interactie tussen de eiwitten van belang waarmee ze zijn gefuseerd.

Over het algemeen hebben op bioluminescentie gebaseerde methoden enkele voordelen ten opzichte van methoden die gebaseerd zijn op fluorescentie. Bioluminescente signalen hebben een hogere signaal-ruisverhouding omdat de achtergrondlumescentie verwaarloosbaar is in vergelijking met het luciferase-afgeleide ^signaal16. Fluorescentie-gebaseerde benaderingen daarentegen lijden meestal aan een relatief hoge achtergrond veroorzaakt door het fenomeen van autofluorescentie. Bovendien is bioluminescentie minder schadelijk voor de geanalyseerde cellen dan fluorescentie, omdat het in het eerste geval niet nodig is om het monster te prikkelen. Om die redenen concurreren bioluminescente benaderingen voor het bestuderen van PPI’s in vivo met de veelgebruikte fluorescerende methoden zoals Förster Resonance Energy Transfer (FRET) of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).

Ons protocol is gebaseerd op verwijzende luminescentie verkregen voor de eiwitcombinatie die van belang is voor luminescentie verkregen voor de controlecombinatie. De laatste omvat een van de geteste eiwitten die is gefuseerd met een groter fragment en een controle-eiwit (bijv. HaloTag), gefuseerd met een kleiner fragment. De laatste is een eiwit van bacteriële oorsprong waarvan niet wordt verwacht dat het interageert met een van de eiwitten van zoogdieren. Het gebruik van dit eiwit als controle stelt beperkingen aan de topologie van de Golgi-residente paren van eiwitten die moeten worden geanalyseerd. Omdat in zoogdiercellen dit eiwit wordt gesynthetiseerd in het cytoplasma, moeten beide eiwitten van belang ten minste één cytoplasmatische staart hebben.

Deze aanpak kan met name nuttig zijn voor de eerste screening van PPI’s. Het kan de voorkeursmethode worden wanneer de fusie-eiwitten van belang worden uitgedrukt op niveaus die eenvoudigweg onvoldoende zijn om andere benaderingen toe te passen. Evenzo kan de split luciferase-complementatietest de beste optie zijn als de eiwitten van belang op hoge niveaus tot expressie komen, maar dit heeft een negatieve invloed op hun subcellulaire lokalisatie of het is bekend dat het niet-specifieke interacties forceert. Omdat het kleinere fragment slechts 11 aminozuren bevat, kan de split luciferase complementatietest worden toegepast wanneer het gebruik van grotere tags onmogelijk is. Ten slotte kan het worden gebruikt om gegevens die zijn verkregen met behulp van andere technieken verder te bevestigen, zoals in het hier gepresenteerde geval.

Protocol

1. Generatie van expressieplasmiden Onderzoek de membraantopologie van de eiwitten van belang met behulp van een topologie voorspellende tool. Ontwerp de kloonstrategie zo dat de grotere en kleinere fragmenten het cytoplasma onder ogen zien zodra de fusie-eiwitten in Golgi-membranen zijn ingebracht. Als, zoals in het hier gepresenteerde geval, zowel N- als C-termini van de betrokken eiwitten cytoplasmatisch georiënteerd zijn, tag de eiwitten dan op acht mogelijke manieren (zie fi…

Representative Results

Om de meest betrouwbare gegevens in deze benadering te verkrijgen, moeten alle mogelijke combinaties worden getest (zie figuur 1). Tegelijkertijd moeten positieve en negatieve controles worden opgenomen. De positieve controle moet bestaan uit de twee eiwitten waarvan bekend is dat ze interageren, waarvan de ene is gefuseerd met het grotere fragment en de andere is gefuseerd met het kleinere fragment. De negatieve controle zou idealiter moeten bestaan uit de twee niet-interagerende type III-m…

Discussion

Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat de demonstratie mogelijk maakt van heterologe complexen gevormd tussen Golgi-residente type III-membraaneiwitten, zoals NST’s, met behulp van de split luciferase-complementatietest. De voorgestelde benadering van gegevensanalyse en -interpretatie omvat het relateren van de luminescentie verkregen voor de eiwitcombinatie van belang aan de luminescentie verkregen voor de overeenkomstige controlecombinatie, die is samengesteld uit een van de eiwitten van belang gefuseerd met het…

Materials

0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler