गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन द्वारा विभाजित Luciferase पूरक परख का उपयोग कर द्वारा गठित हेटरोलॉगस परिसरों का प्रदर्शन
Summary
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन के बीच हेटरोलॉगस इंटरैक्शन की घटना को प्रदर्शित करना है, जिसमें साइटोप्लाज्मिक रूप से उजागर एन- और / या सी-टर्मिनी लाइव स्तनधारी कोशिकाओं में विभाजित लूसिफेरस पूरकता परख के सबसे हालिया संस्करण का उपयोग किया जाता है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य न्यूक्लियोटाइड चीनी ट्रांसपोर्टरों (एनएसटी) द्वारा गठित हेटरोलॉगस कॉम्प्लेक्स का प्रदर्शन करने के लिए स्प्लिट लूसिफेरस पूरकता के सबसे हालिया संस्करण की प्रयोज्यता का पता लगाना है। ये ईआर- और गोल्गी-निवासी मल्टीट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन साइटोप्लाज्मिक रूप से संश्लेषित न्यूक्लियोटाइड शर्करा को ऑर्गेनेल झिल्ली में ले जाते हैं ताकि एंजाइमों की आपूर्ति की जा सके जो अपने सब्सट्रेट के साथ ग्लाइकोसिलेशन की मध्यस्थता करते हैं। एनएसटी डिमर और / या उच्च ओलिगोमर्स के रूप में मौजूद हैं। विभिन्न एनएसटी के बीच हेटरोलॉगस इंटरैक्शन की भी सूचना दी गई है। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या तकनीक एनएसटी हेटरोमेराइजेशन की घटना का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, हमने इसे दो गोल्गी-निवासी एनएसटी के संयोजन के खिलाफ परीक्षण किया जो पहले कई अन्य तरीकों से संबद्ध करने के लिए दिखाया गया है। लूसिफेरस पूरक परख गोल्गी-निवासी झिल्ली प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त प्रतीत होता है, क्योंकि इसे उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता नहीं होती है, जो अक्सर प्रोटीन मिसलोकलाइजेशन को ट्रिगर करता है और झूठी सकारात्मकता के जोखिम को बढ़ाता है।
Introduction
यह पांडुलिपि एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन करती है ताकि गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन के बीच हेटरोलॉगस इंटरैक्शन की उपस्थिति की जांच की जा सके, जो विभाजन लूसिफेरस पूरक परख के सबसे हालिया संस्करण का उपयोग करके क्षणिक रूप से संक्रमित मानव कोशिकाओं में है। प्रक्रिया को न्यूक्लियोटाइड चीनी ट्रांसपोर्टरों (एनएसटी) के खिलाफ सबसे बड़े पैमाने पर परीक्षण किया गया है, लेकिन हम अन्य गोल्गी-निवासी टाइप III झिल्ली प्रोटीन के लिए सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने में भी सक्षम थे जिनके एन- और / या सी-टर्मिनी साइटोप्लाज्म का सामना कर रहे हैं।
हमारा शोध समूह मैक्रोमोलेक्यूल्स के ग्लाइकोसिलेशन में एनएसटी की भूमिका की पड़ताल करता है। एनएसटी गोल्गी- और / या ईआर-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन हैं, जिसमें एन- और सी-टर्मिनी ऑर्गेनेलर झिल्ली 1 के साइटोप्लाज्मिक पक्ष का सामना कर रहे हैं। माना जाता है कि एनएसटी अपने सब्सट्रेट के साथ ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ की आपूर्ति करने के लिए ऑर्गेनेल झिल्ली में न्यूक्लियोटाइड-सक्रिय शर्करा ले जाते हैं। एनएसटी डिमर और / या उच्चतर ओलिगोमर्स 2,3,4,5,6,7,8,9,10 बनाते हैं। इसके अलावा, विभिन्न एनएसटी के बीच हेटरोलॉगस इंटरैक्शन भी 6,11 की सूचना दी गई है। एनएसटी को कार्यात्मक रूप से संबंधित ग्लाइकोसिलेशन एंजाइमों के साथ परिसर बनाने के लिए भी प्रदर्शित किया गया था12,13,14। हमने वर्तमान में उपयोग की जाने वाली तकनीक, प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग (एफएलआईएम) -आधारित फ्रेट दृष्टिकोण के विकल्प की मांग की, एनएसटी और कार्यात्मक रूप से संबंधित गोल्गी-निवासी प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए, इसलिए हमने विभाजित लूसिफेरस पूरक परख का परीक्षण करने का फैसला किया। इसने हमें एक एनएसटी और एक कार्यात्मक रूप से संबंधित ग्लाइकोसिलेशन एंजाइम 9 के बीच एक उपन्यास बातचीत की पहचान करने की अनुमति दी।
विभाजित लूसिफेरस पूरक परख, NanoBiT के सबसे हाल के संशोधन, प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत में प्रयोग किया जाता है15. यह दो टुकड़ों से लूसिफेरस एंजाइम (जैसे, नैनोल्यूक) के पुनर्गठन पर निर्भर करता है – बड़ा एक, जिसे बड़े बीआईटी या एलजीबीआईटी के रूप में जाना जाता है, एक 17.6 केडीए प्रोटीन, और छोटा, केवल 11 अमीनो एसिड से बना होता है, जिसे छोटे बीआईटी या एसएमबीआईटी के रूप में जाना जाता है। ब्याज के दो प्रोटीन पूरक टुकड़ों के साथ जुड़े हुए हैं और क्षणिक रूप से एक मानव सेल लाइन में व्यक्त किए जाते हैं। यदि दो संलयन प्रोटीन बातचीत करते हैं, तो सेल-पारगम्य सब्सट्रेट के अलावा सीटू में एक ल्यूमिनेसेंस का उत्पादन किया जाता है। इन दो टुकड़ों को अनुकूलित किया गया है ताकि वे न्यूनतम आत्मीयता के साथ जुड़ें, जब तक कि ब्याज के प्रोटीन के बीच बातचीत द्वारा एक साथ नहीं लाया जाता है, जिससे वे जुड़े हुए हैं।
सामान्य तौर पर, बायोल्यूमिनेसेंस-आधारित विधियों में प्रतिदीप्ति के आधार पर लोगों पर कुछ फायदे हैं। बायोल्यूमिनेसेंट संकेतों में एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है क्योंकि पृष्ठभूमि ल्यूमिनेसेंस लूसिफेरस-व्युत्पन्न सिग्नल 16 की तुलना में नगण्य है। इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोण आमतौर पर ऑटोफ्लोरेसेंस की घटना के कारण अपेक्षाकृत उच्च पृष्ठभूमि से पीड़ित होते हैं। इसके अलावा, बायोल्यूमिनेसेंस प्रतिदीप्ति की तुलना में विश्लेषण की गई कोशिकाओं के लिए कम हानिकारक है, क्योंकि पूर्व मामले में नमूने को उत्तेजित करने की कोई आवश्यकता नहीं है। उन कारणों से विवो में पीपीआई का अध्ययन करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंट दृष्टिकोण आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले फ्लोरोसेंट तरीकों जैसे कि फॉरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) या Bimolecular प्रतिदीप्ति पूरकता (BiFC) को पछाड़ते हैं।
हमारा प्रोटोकॉल नियंत्रण संयोजन के लिए प्राप्त ल्यूमिनेसेंस के लिए ब्याज के प्रोटीन संयोजन के लिए प्राप्त ल्यूमिनेसेंस को संदर्भित करने पर निर्भर करता है। उत्तरार्द्ध में परीक्षण किए गए प्रोटीनों में से एक शामिल है जो एक बड़े टुकड़े और एक नियंत्रण प्रोटीन (जैसे, हेलोटैग) के साथ जुड़ा हुआ है, जो एक छोटे टुकड़े के साथ जुड़ा हुआ है। उत्तरार्द्ध जीवाणु मूल का एक प्रोटीन है जिसे स्तनधारी प्रोटीन में से किसी के साथ बातचीत करने की उम्मीद नहीं है। एक नियंत्रण के रूप में इस प्रोटीन का उपयोग करने से विश्लेषण किए जाने वाले प्रोटीन के गोल्गी-निवासी जोड़े की टोपोलॉजी की सीमाएं हैं। चूंकि स्तनधारी कोशिकाओं में यह प्रोटीन साइटोप्लाज्म में संश्लेषित होता है, इसलिए ब्याज के दोनों प्रोटीनों में कम से कम एक साइटोप्लाज्मिक पूंछ होनी चाहिए।
यह दृष्टिकोण पीपीआई की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। यह पसंद की विधि बन सकती है जब ब्याज के संलयन प्रोटीन को उन स्तरों पर व्यक्त किया जाता है जो अन्य दृष्टिकोणों को लागू करने के लिए अपर्याप्त हैं। इसी तरह, विभाजित लूसिफेरस पूरक परख सबसे अच्छा विकल्प हो सकता है यदि ब्याज के प्रोटीन उच्च स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं, लेकिन यह उनके उपकोशिकीय स्थानीयकरण को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करता है या गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन को मजबूर करने के लिए जाना जाता है। चूंकि छोटे टुकड़े में केवल 11 अमीनो एसिड होते हैं, इसलिए बड़े टैग का उपयोग करते समय विभाजित लूसिफेरस पूरक परख को लागू किया जा सकता है असंभव है। अंत में, इसे अन्य तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त डेटा की पुष्टि करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, जैसा कि यहां प्रस्तुत मामले में है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो गोल्गी-निवासी प्रकार III झिल्ली प्रोटीन, जैसे कि एनएसटी के बीच गठित हेटरोलॉगस कॉम्प्लेक्स के प्रदर्शन को सक्षम करता है, जो विभाजित लूसिफेरस पूरक परख का उप…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र (एनसीएन), क्राको, पोलैंड से अनुदान संख्या 2016/23/D/NZ3/01314 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
