Demonstration av heterologa komplex som bildas av Golgi-Resident Typ III Membranproteiner med split luciferas komplementeringsanalys

Summary

Protokollet som presenteras här är avsett att visa förekomsten av heterologa interaktioner mellan Golgi-resident typ III membran proteiner med cytoplasmiskt exponerade N- och/eller C-termini i levande däggdjursceller med den senaste varianten av den delade luciferas komplementering assay.

Abstract

Målet med detta protokoll är att utforska tillämpligheten av den senaste varianten av split luciferas komplementering för att demonstrera heterologa komplex som bildas av nukleotid sockertransportörer (NSTs). Dessa ER- och Golgi-bosatta multitransmembranproteiner bär de cytoplasmiskt syntetiserade nukleotidsocker över organellmembran för att leverera enzymer som förmedlar glykosylering med sina substrat. NST finns som dimers och/eller högre oligomerer. Heterologous interaktioner mellan olika NSTs har också rapporterats. För att verifiera om tekniken är lämplig för att studera fenomenet NST heteromerization, testade vi den mot en kombination av de två Golgi-bosatta NSTs som tidigare har visat sig associera på flera andra sätt. Luciferas komplementeringsanalysen verkar vara särskilt lämplig för att studera interaktioner mellan Golgi-bosatta membranproteiner, eftersom det inte kräver höga uttrycksnivåer, vilket ofta utlöser proteinfellokalisering och ökar risken för falska positiva identifieringar.

Introduction

Detta manuskript beskriver ett steg-för-steg protokoll för att kontrollera förekomsten av heterologa interaktioner mellan Golgi-bosatta typ III membran proteiner i transientt transfected mänskliga celler med den senaste varianten av den delade luciferas komplementering assay. Förfarandet har testats mest mot nukleotidsockertransportörer (NSTs) men vi kunde också få positiva resultat för andra Golgi-bosatta typ III-membranproteiner vars N- och/eller C-termini står inför cytoplasma.

Vår forskargrupp undersöker NST:s roll i glykosylering av makromolekyler. NSTs är Golgi- och/eller ER-resident typ III membranproteiner med N- och C-termini som vetter mot den cytoplasmiska sidan av organellarmembranet1. NSTs tros bära nukleotidaktiverade sockerarter över organellmembran för att förse glykosyltransferaser med sina substrat. NSTs bildar dimers och/eller högre oligomerer2,3,4,5,6,7,8,9,10. Dessutom har heterologa interaktioner mellan olika NSTs också ^{rapporterats6,11}. NSTs visade sig också bilda komplex med funktionellt relaterade glykosylering enzymer12,13,14. Vi sökte efter ett alternativ till den nuvarande tekniken, fluorescens livstid imaging (FLIM)-baserade FRET-metoden, för att studera interaktioner av NSTs och funktionellt relaterade Golgi-bosatta proteiner, så vi bestämde oss för att testa den delade luciferas komplementeringsanalysen. Det tillät oss att identifiera en ny interaktion mellan en NST och ett funktionellt relaterat glykosylering ^enzym9.

Den senaste ändringen av den delade luciferaskomplementeringsanalysen, NanoBiT, används i protokollet som presenteras ^här15. Det förlitar sig på rekonstitutionen av luciferasenzymet (t.ex. NanoLuc) från de två fragmenten – den stora, som kallas stor BiT eller LgBiT, ett 17,6 kDa-protein och det lilla, bestående av endast 11 aminosyror, kallade små BiT eller SmBiT. De två proteinerna av intresse smälts samman med de kompletterande fragmenten och uttrycks övergående i en mänsklig cellinje. Om de två fusionsproteinerna samverkar produceras en luminiscens på plats efter tillsats av ett cellgenomsläppligt substrat. Dessa två fragment har optimerats så att de associerar med minsta affinitet om de inte sammanförs av en interaktion mellan de proteiner av intresse de smälts till.

I allmänhet har bioluminescensbaserade metoder vissa fördelar jämfört med de som bygger på fluorescens. Bioluminescerande signaler har ett högre signal-till-brus-förhållande eftersom bakgrundsluminescensen är försumbar jämfört med den luciferas-härledda ^signalen16. Fluorescensbaserade metoder lider däremot vanligtvis av en relativt hög bakgrund orsakad av fenomenet autofluorescens. Dessutom är bioluminescens mindre skadligt för de analyserade cellerna än fluorescens, eftersom det i det tidigare fallet inte finns något behov av att excitera provet. Av dessa skäl konkurrerar bioluminescerande metoder för att studera protonpumpshämmare in vivo ut de vanliga fluorescerande metoderna som Förster Resonance Energy Transfer (FRET) eller Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).

Vårt protokoll bygger på att hänvisa luminiscens erhålls för proteinkombinationen av intresse för luminiscens som erhållits för kontrollkombinationen. Det senare inkluderar det av de testade proteinerna som smälts samman med ett större fragment och ett kontrollprotein (t.ex. HaloTag), smält med ett mindre fragment. Det senare är ett protein av bakteriellt ursprung som inte förväntas interagera med något av däggdjursproteiner. Att använda detta protein som en kontroll innebär begränsningar för topologin hos de Golgi-bosatta par av proteiner som ska analyseras. Eftersom detta protein i däggdjursceller syntetiseras i cytoplasma bör båda proteinerna av intresse ha minst en cytoplasmisk svans.

Detta tillvägagångssätt kan vara särskilt användbart vid inledande screening av protonpumpshämmare. Det kan bli en metod när fusionsproteinerna av intresse uttrycks på nivåer som helt enkelt är otillräckliga för att andra metoder ska kunna tillämpas. På samma sätt kan den delade luciferaskomplementeringsanalysen vara det bästa alternativet om proteinerna av intresse uttrycks på höga nivåer, men detta påverkar deras subcellulära lokalisering negativt eller är känt för att tvinga icke-specifika interaktioner. Eftersom det mindre fragmentet bara har 11 aminosyror kan den delade luciferaskomplementeringsanalysen tillämpas när det är omöjligt att använda större taggar. Slutligen kan den användas för att ytterligare bekräfta uppgifter som erhållits med hjälp av andra tekniker, som i det fall som presenteras här.

Protocol

1. Generering av uttrycksplasmider Undersök membrantopologin hos de proteiner som är av intresse med hjälp av ett topologiförutsägningsverktyg. Utforma kloningsstrategin så att de större och mindre fragmenten kommer att möta cytoplasman när fusionsproteinerna har satts in i Golgi-membranen. Om, som i det fall som presenteras här, både N- och C-termini av proteinerna av intresse är cytoplasmiskt orienterade, tagga proteinerna på åtta möjliga sätt (se figur 1B</stron…

Representative Results

För att få de mest tillförlitliga uppgifterna i detta tillvägagångssätt bör alla möjliga kombinationer testas (se figur 1). Parallellt bör positiva och negativa kontroller inkluderas. Den positiva kontrollen bör bestå av de två proteiner som är kända för att interagera, varav det ena smälts samman med det större fragmentet och det andra smälts samman med det mindre fragmentet. Den negativa kontrollen bör idealiskt bestå av de två icke-interagerande typ III-membranprotein…

Discussion

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som möjliggör demonstration av heterologa komplex som bildas mellan Golgi-bosatta typ III membranproteiner, såsom NSTs, med hjälp av den delade luciferaskomplementeringsanalysen. Det föreslagna tillvägagångssättet för dataanalys och tolkning innebär att den luminiscens som erhållits för proteinkombinationen av intresse för den luminiscens som erhållits för motsvarande kontrollkombination, som består av ett av de proteiner av intresse som smälts samman med…

Materials

0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler