عزل الملتحمة والهوية في الفئران
Summary
يقدم هنا بروتوكول لعزل وتضخيم البكتيريا اللاهوائية الهوائية والكلية الملتحمة الماوس الملتحمة باستخدام مسحة عين فريدة من نوعها وخطوة إثراء قائمة على الثقافة مع تحديد لاحق من خلال الأساليب القائمة على الميكروبيولوجية وقياس الطيف الكتلي MALDI-TOF.
Abstract
كان سطح العين يعتبر ذات مرة محصنا متميزا وغير أحيائيا ، ولكن يبدو مؤخرا أن هناك وجودا صغيرا ، ولكن مستمرا. وقد كان تحديد ورصد الأنواع البكتيرية في الغشاء المخاطي العيني تحديا بسبب وفرة منخفضة وتوافر محدود من المنهجية المناسبة لنمو commensal وتحديد. هناك نهجان قياسيان: الثقافة القائمة أو أساليب تسلسل الحمض النووي. الطريقة الأولى هي إشكالية بسبب البكتيريا القابلة للاسترداد محدودة والنهج الثاني يحدد البكتيريا الحية والميتة على حد سواء مما يؤدي إلى تمثيل شاذ من الفضاء العين. طورنا طريقة قوية وحساسة للعزل البكتيري من خلال البناء على تقنيات الاستزراع الميكروبيولوجي القياسية. هذه تقنية تعتمد على المسحة ، باستخدام مسحة رقيقة مصنوعة من “المختبر” تستهدف الملتحمة السفلية ، تليها خطوة تضخيم للأجناس اللاهوائية الهوائية والكلية. وقد سمح لنا هذا البروتوكول لعزل وتحديد الأنواع الملتحمة مثل Corynebacterium spp., Coagulase المكورات العنقودية السلبية spp., العقدية spp. هذا النهج هو مناسبة لتحديد التنوع commensal في الفئران في ظل ظروف المرض المختلفة.
Introduction
الهدف من هذا البروتوكول هو تعزيز عزلة محددة من الميكروبات الهوائية والكلية غير الهوائية القابلة للحياة والنادرة من الملتحمة العينية لتوصيف الميكروبيوم العيني. وقد عرضت دراسات مستفيضة المجتمعات المخاطية كومينسال على الجلد والأمعاء والجهاز التنفسي والأعضاء التناسلية وتبين أن هذه المجتمعات تؤثر على تطور الجهاز المناعي والاستجابة1و2و3. وقد ثبت أن المجتمعات commensal العين لتغيير خلال أمراض معينة، مثل مرض جفاف العين4، متلازمةشيغرن5 ومرض السكري6. ومع ذلك ، فإن القدرة على تحديد مجتمع كومينسال سطح العين النموذجي يعوقها وفرة منخفضة نسبيا مقارنة مع غيرها من المواقع المخاطية6،7،8. وهذا يثير جدلا حول ما إذا كان هناك ميكروبيوم العين المقيم وإذا كان موجودا، ما إذا كان يختلف عن ميكروبيوم الجلد وبالتالي، تأثيره المحلي على تطوير الجهاز المناعي الفطري والاستجابة. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في حل هذه المسألة.
عموما، تستند النهج لتحديد مكانة commensal العين على التسلسل والتقنيات القائمة على الثقافة4،7،9. 16 S rDNA التسلسل وتحليل BRISK7 تظهر تنوعا أوسع من التقنيات القائمة على الثقافة، ولكن غير قادرين على التفريق بين الميكروبات الحية والميتة. نظرا لأن سطح العين معاد للعديد من الميكروبات بسبب خصائص الفيلم المسيل للدموع المضادة للميكروبات4 التي تولد مجموعة كبيرة من شظايا الحمض النووي ، فإن النهج القائمة على الحمض النووي ستكتشف هذه القطع الأثرية التي قد تحرف البيانات نحو تحديد البكتيريا الميتة ككومينسالات مقيمة بدلا من الملوثات. وهذا يؤدي إلى تحديد commensal شاذة وتوصيف الفضاء العين بأنها أعلى في وفرة الميكروبات والتنوع10. وهذا يجعل من الصعب تحديد الميكروبيوم العيني المقيم عن طريق الأساليب القائمة على الحمض النووي. حيث أن التقنيات المستندة إلى الثقافة القياسية غير قادر على الكشف عن commensals لأن التحميل منخفض جدا11. أسلوبنا يحسن على الممارسات القياسية باستخدام مسحة رقيقة التي يمكن أن تستهدف الملتحمة، وبالتالي تجنب التلوث من الجلد المجاور، فضلا عن مفهوم أن الكائنات الحية قابلة للحياة يمكن إثراء من قبل ثقافة قصيرة في وسائل الإعلام الغنية بالمغذيات بهدف إحياء قابلة للحياة ولكن غير قابلة للتكريس، فضلا عن إثراء للميكروبات نادرة قابلة للحياة.
النتائج، وفرة نسبية من commensals العين لكل مسحة العين، تميز الميكروبيوم المقيم الملتحمة ومهمة لأغراض المقارنة. تظهر بياناتنا أن هناك فرقا بين الجلد والميكروبات الملتحمة ، بالإضافة إلى تنوع أكبر مع زيادة العمر والفرق المحدد للجنس في الوفرة. وعلاوة على ذلك ، فقد وجد هذا النهج بشكل مستنسخ اختلافات كومينسال في الفئرانالمغلوبة 12. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لوصف الميكروبيوم العيني الذي قد يختلف بسبب ممارسات التكتكة أو الجغرافيا أو حالة المرض ، وكذلك الآثار المحلية لمييضات ومنتجات commensal على تطوير الجهاز المناعي والاستجابة له.
Protocol
Representative Results
Discussion
بسبب الحالة البكتيرية للسطح العيني ، واجهت العديد من المختبرات صعوبة في عزل commensals العين7،20، مما أدى إلى انخفاض عدد العينات مع النمو وانخفاض وفرة وانخفاض التنوع8. هذه الطريقة تحسن بشكل كبير على الممارسات التقليدية الثقافة4،<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
دعم التمويل من P30 DK034854 VY وLB والدراسات في مركز ماساتشوستس المضيف الميكروبيوم والتمويل من NIH / NEI R01 EY022054 دعم MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
