マウスにおける結膜経月の分離と同定
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Brigham and Women’s Hospital,Harvard Medical School, 2Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women’s Hospital,Harvard Medical School, 3Clinical Microbiology Laboratory, Department of Pathology, Brigham and Women’s Hospital,Harvard Medical School
Summary
ここでは、微生物学的手法とMALDI-TOF質量分析によるその後の同定を用いたユニークな眼綿棒および培養ベースの濃縮ステップを用いた有酸素性および気性嫌気性マウスの結合性のコンメンサルト菌の分離と増幅のためのプロトコルを提示する。
Abstract
眼表面はかつて免疫特権と非生物性と考えられていたが、最近では小さいが持続的な経常存在があるように見える。眼粘膜における細菌種の同定とモニタリングは、その存在量が少なく、産経的成長と同定のための適切な方法論の利用可能性が限られているため、困難であった。培養法とDNAシーケンシング法の2つの標準的なアプローチがあります。第1の方法は、限られた回収可能な細菌のために問題であり、第2のアプローチは、眼空間の異常な表現につながる生きている細菌と死んだ細菌の両方を識別する。標準的な微生物培養技術を基に、細菌の分離のための堅牢で高感度な方法を開発しました。これは、下の結膜を標的とする「ラボ内」製の薄い綿棒を利用した綿棒ベースの技術であり、続いて有酸素性および好気性嫌気性性の生殖器の増幅ステップを利用する。このプロトコルは、 コリネバクテリウムspp.、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌spp.、ストレプトコッカス属などの結膜種を分離し、同定することを可能にしました。このアプローチは、異なる疾患条件下でのマウスの男性の多様性を定義するのに適している。
Introduction
このプロトコルの目的は、眼のマイクロバイオームを特徴付けるために、眼結膜から実行可能でまれな有酸素性および気性嫌気性微生物の特異的な分離を強化することである。広範な研究は、皮膚、腸、呼吸器および生殖管上の経経膜粘膜群集をプロファイリングし、これらのコミュニティが免疫系および応答1、2、3の発達に影響を及ぼすことを示している。眼部の男性群は、ドライアイ病4、シェーグレン症候群5および糖尿病6などの特定の疾患病態の間に変化することが示されている。しかし、典型的な眼表面の連動性共同体を定義する能力は、他の粘膜部位6、7、8と比較して比較的少ない存在によって妨げられている。これは、常駐眼マイクロバイオームがあるかどうか、それが存在する場合、それが皮膚マイクロバイオームと異なるかどうか、そして結果的に、自然免疫系の発達と応答に対する局所的な影響があるかどうかについての論争を促す。このプロトコルは、この問題を解決するのに役立ちます。
一般に、連視ニッチを定義するアプローチは、シーケンシングと文化ベースの技術4、7、9に基づいています。16 S rDNAシーケンシングおよびBRISK分析7は、培養ベースの技術よりも広い多様性を示すが、生きた微生物と死んだ微生物を区別することができない。眼表面は、大量のDNA断片を生成する涙膜の抗菌特性4のために多くの微生物に敵対しているため、DNAベースのアプローチは、汚染物質ではなく常駐的な汚染物質として死んだ細菌の同定に向けてデータを歪める可能性のあるこれらのアーティファクトを検出します。これは、微生物の存在量および多様性10においてより高いとして眼空間の異常な分別識別および特徴付けをもたらす。これにより、DNAベースの方法を介して常駐眼マイクロバイオームを定義することが困難になります。一方、標準的な文化ベースの技術は、負荷が低すぎるため、コメンサルを検出することができません11.我々の方法は、結膜を標的とすることができる薄い綿棒を使用して、近隣の皮膚からの汚染を避けることによって、ならびに実行可能な生物が生存可能であるが非カルト的な、ならびに希少生存微生物を豊かにすることを目的に、栄養密度の高い培地の短い培養によって豊かにすることができるという概念を使用することによって、標準的な慣行を改善する。
結果は、眼綿棒あたりの眼のコメンの相対的な豊富さ、結膜の常駐微生物叢を特徴付け、比較目的のために重要である。我々のデータは、皮膚と結膜微生物叢の間に違いがあり、年齢の増加と性別固有の豊富な違いと共に多様性が高いことを示している。さらに、このアプローチは、ノックアウトマウス12における因果的な違いを再現的に発見した。このプロトコルは、ケージの慣行、地理、または疾患状態、および免疫系の発達および応答に対するコメンサル代謝産物および産物の局所的影響によって異なる可能性のある眼マイクロバイオームを記述するために適用することができる。
Protocol
マウスを含むすべての手順は、制度的動物ケアと使用委員会のガイドラインに従います。微生物や汚染される可能性のある材料を扱う際には、(お客様の機関環境安全衛生部門が指示する)実験室の安全ガイドラインに従ってください。バイオハザード汚染材料の廃棄前に、適切な廃棄物容器と除染手順を使用してください。 1.アイスワブの準備、作業場のセットアップ、マ…
Representative Results
めっきのための異なる方法を示す目の綿棒板の代表的な結果は、C57BL/6マウスからの形態学的に多様な分離株を示す 図3A に示されている。各別個の分離物について、コロニーはストリップに数え、相対的な豊富さ、目の綿棒あたりのユニークなコロニー形成単位(CFUs)を計算し、比較目的でプロットした。微生物学的特徴付けのために、細菌を個々のマウスアイスワブプ?…
Discussion
眼表面の小児性細菌状態のために、多くの研究室は、7、20の眼部の分離が困難であり、その結果、成長、低存在量、低多様性8の低いサンプル数を生じる。この方法は、濃縮工程の追加、およびMALDI-TOF MSによるアイスワブおよび同定を加えることによって、標準的な培養プラクティス4,21?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P30 DK034854からの資金は、マサチューセッツ州ホストマイクロバイオームセンターでのVY、LBおよび研究を支援し、NIH/ NEI R01 EY022054からの資金提供はMGをサポートしました。
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
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Cite This Article
Smith-Page, K., Kugadas, A., Lin, T., Delaney, M., Bry, L., Gadjeva, M. Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice. J. Vis. Exp. (171), e61672, doi:10.3791/61672 (2021).