마우스의 결막 장금 격리 및 식별
Summary
여기에 제시된 것은 미생물 기반 방법 및 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 후속 식별을 통해 독특한 눈 면봉 및 배양 기반 농축 단계를 사용하여 호기성 및 학부성 혐기성 마우스 결막 성 세균의 격리 및 증폭을 위한 프로토콜이다.
Abstract
안구 표면은 한 번 면역 특권과 비생물으로 간주되었다, 하지만 최근에는 작지만 지속적인 막연한 막대한 존재가 있는 것으로 보인다. 안구 점막에서 세균 종의 식별 및 모니터링은 그들의 낮은 풍부와 인문 성장 및 식별을위한 적절한 방법론의 제한된 가용성으로 인해 도전하고있다. 문화 기반 또는 DNA 염기서열 분석 방법의 두 가지 표준 접근 법이 있습니다. 첫 번째 방법은 제한된 회수 가능한 박테리아로 인해 문제가 되고 두 번째 접근법은 안구 공간의 비정상적인 표현으로 이어지는 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 모두 식별합니다. 우리는 표준 미생물 배양 기술을 기반으로 세균 격리를 위한 견고하고 민감한 방법을 개발했습니다. 이것은 “실험실”이 낮은 결막을 대상으로 하는 얇은 면봉을 활용한 면봉 기반 기술이며, 그 다음으로 호기성 및 학부 해부학 적 제네라에 대한 증폭 단계가 뒤따릅니다. 이 프로토콜은 우리가 코린 박테리움 spp., Coagulase 네거티브 황색포도상구균 spp., 연쇄상 구균 spp등과 같은 결막 종을 분리하고 식별할 수 있게 했습니다. 접근은 다른 질병 조건의 마우스에 있는 막증을 정의하는 것이 적합합니다.
Introduction
이 프로토콜의 목적은 안구 내막 에서 실행 가능하고 희귀 한 호기성 및 학부 성 혐기성 미생물의 특정 절연을 강화하여 안구 미생물군유전체를 특성화하는 것입니다. 광범위한 연구는 피부, 창자, 호흡기 및 생식기에 대한 막수 점막 커뮤니티를 프로파일드하고 이러한 지역 사회가 면역 체계의 발달과 반응1,2,3에영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 안구 내문 공동체는 안구건조증4,쇼그렌 증후군5 및 당뇨병6과같은 특정 질환 병리학 중에 변화하는 것으로 나타났다. 그러나, 전형적인 안구 표면 발생 공동체를 정의하는 능력은 다른 점막부위에비해 상대적으로 낮은 풍요로움에 의해 방해된다6,7,8. 이것은 상주 안구 미생물군유전체가 있는지, 그리고 존재하는 경우에, 피부 microbiome와 다른지, 결과적으로, 타고난 면역 계통 발달 및 반응에 그것의 현지 효력이 있는지를 통해 논쟁을 자극합니다. 이 프로토콜은 이 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
일반적으로, 안구 공생 틈새 시장을 정의하는 접근법은 시퀀싱 및 문화 기반 기술4,7,9에기초한다. 16 S rDNA 염기서열 분석 및 BRISK 분석7은 배양 기반 기술보다 더 넓은 다양성을 나타내지만 살아있는 미생물과 죽은 미생물을 구별할 수는 없습니다. 안구 표면은 눈물 필름의 항균 특성4로 인해 많은 미생물에 적대적이기 때문에 많은 DNA 단편을 생성하며, DNA 기반 접근법은 오염물질이 아닌 상주 교향곡으로 죽은 박테리아의 식별으로 데이터를 왜곡할 수 있는 이러한 유물을 검출할 것이다. 이로 인해 미생물의 풍부와다양성(10)에서더 높은 것으로 안구 공간의 비정상적인 장신 식별 및 특성화가 발생한다. 이것은 DNA 기지를 둔 방법을 통해 상주 안구 미생물군유전체를 정의하는 것을 어렵게 합니다. 반면, 표준 배양 기반 기술은 하중이 너무 낮기 때문에11을감지할 수 없습니다. 우리의 방법은 결막을 표적으로 할 수 있는 얇은 면봉을 사용하여 표준 관행을 향상시키고, 따라서 이웃 피부에서 오염을 피하고, 실행 가능한 유기체가 가능한 그러나 비 culturable를 소생하는 것을 목표로 영양 조밀한 매체에 있는 짧은 문화에 의해 풍부해질 수 있다는 개념뿐만 아니라, 희귀 한 생존 가능한 미생물을 위해 풍부하게 합니다.
결과, 눈 면봉 당 안구 공자의 상대적인 풍부, 결막 상주 미생물군유전체를 특성화 하 고 비교 목적을 위해 중요 하다. 우리의 데이터는 피부와 결막 미생물의 차이뿐만 아니라 증가 된 나이와 풍부한 성별 특정 차이와 더 큰 다양성이 있음을 보여줍니다. 더욱이, 이러한 접근법은 녹아웃마우스(12)에서의기생 차이를 재현적으로 발견했다. 이 프로토콜은 caging 관행, 지리, 또는 질병 상태뿐만 아니라 면역 계통 발달 및 반응에 대한 교만 대사 산물 및 제품의 국소 효과로 인해 달라질 수 있는 안구 미생물군유전체를 설명하기 위해 적용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
안구 표면의 파시균 상태로 인해 많은 실험실에서 안구 공생을 분리하는 데어려움이 있어7,20의성장, 낮은 풍부및 낮은 다양성8을가진 시료수가 적어집니다. 이 방법은 MALDI-TOF MS에 의한 재설계된 눈 면봉 및 식별뿐만 아니라 농축 단계의 첨가에 의해 표준 배양 관행4,21에 크게 향상됩니다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P30 DK034854의 자금 지원VY, LB 및 매사추세츠 호스트-미생물군유전체 센터의 연구 및 NIH/NEI R01 EY022054의 자금 지원 MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
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