Farelerde Konjonktival Kommenal İzolasyon ve Tanımlama
Summary
Burada sunulan, mikrobiyolojik tabanlı yöntemler ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile daha sonra tanımlanması ile benzersiz bir göz çubuğu ve kültür tabanlı zenginleştirme adımı kullanılarak aerobik ve öğretim üyesi anaerobik fare konjonktival commensal bakterilerin izolasyonu ve amplifikasyonu için bir protokoldür.
Abstract
Oküler yüzey bir zamanlar immün ayrıcalıklı ve abiyotik olarak kabul edildi, ancak son zamanlarda küçük, ancak kalıcı bir kommensal varlık olduğu görülüyor. Oküler mukozadaki bakteri türlerinin tanımlanması ve izlenmesi, düşük bollukları ve kommensal büyüme ve tanımlama için uygun metodolojinin sınırlı metodolojisi nedeniyle zor olmuştur. İki standart yaklaşım vardır: kültür tabanlı veya DNA dizileme yöntemleri. İlk yöntem, sınırlı geri kazanılabilir bakteriler nedeniyle sorunludur ve ikinci yaklaşım, oküler alanın anormal bir temsiline yol açan hem canlı hem de ölü bakterileri tanımlar. Standart mikrobiyolojik kültleme tekniklerini geliştirerek bakteri izolasyonu için sağlam ve hassas bir yöntem geliştirdik. Bu, alt konjonktivayı hedefleyen “laboratuvar içi” yapılmış ince bir çubuk kullanan, ardından aerobik ve öğretim üyesi anaerobik cins için bir amplifikasyon adımı kullanan çubuk tabanlı bir tekniktir. Bu protokol, Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., vb. Yaklaşım, farklı hastalık koşullarında farelerde kommensal çeşitliliği tanımlamak için uygundur.
Introduction
Bu protokolün amacı, oküler mikrobiyomu karakterize etmek için oküler konjonktivadan canlı ve nadir aerobik ve öğretim üyesi anaerobik mikropların spesifik izolasyonunu arttırmaktır. Kapsamlı çalışmalar cilt, bağırsak, solunum ve genital sistemlerdeki kommensal mukozal toplulukların profilini çıkarmıştır ve bu toplulukların bağışıklık sisteminin gelişimini ve yanıt1, 2,3’üetkilediğini göstermektedir. Göz eti kommenal topluluklarının Kuru göz hastalığı4, Sjogren sendromu5 ve diyabet6gibi bazı hastalık patolojileri sırasında değiştiği gösterilmiştir. Yine de, tipik bir oküler yüzey kommenal topluluğunu tanımlama yeteneği, diğer mukozal sitelere kıyasla nispeten düşük bollukları ile engellenir6,7,8. Bu, yerleşik bir oküler mikrobiyom olup olmadığı ve varsa, cilt mikrobiyomundan farklı olup olmadığı ve sonuç olarak doğuştan gelen bağışıklık sistemi gelişimi ve yanıtı üzerindeki yerel etkisi hakkında bir tartışmaya neden olur. Bu protokol bu sorunun çözülmesine yardımcı olabilir.
Genel olarak, oküler kommensal niş tanımlamak için yaklaşımlar sıralama ve kültür tabanlı tekniklere dayanır4,7,9. 16 S rDNA dizilimi ve BRISK analizi7, kültür tabanlı tekniklerden daha geniş bir çeşitlilik gösterir, ancak canlı ve ölü mikroplar arasında ayrım yapamaz. Göz yaşartıcı filmin anti-mikrobiyal özellikleri4 nedeniyle göz yüzeyi birçok mikroplara düşman olduğundan, DNA tabanlı yaklaşımlar, ölü bakterilerin kirleticiler yerine yerleşik kommensallar olarak tanımlanmasına yönelik verileri çarpıtabilecek bu eserleri tespit edecektir. Bu, oküler alanın mikrop bolluğu ve çeşitliliğinde daha yüksek olarak anormal kommensal tanımlama ve niteleme ile sonuçlanır10. Bu, yerleşik oküler mikrobiyomun DNA tabanlı yöntemlerle tanımlanmasını zorlaştırır. Standart kültür tabanlı teknikler, yük çok düşük olduğundan virgülleri algılayamaz11. Yöntemimiz, konjonktivayı hedefleyebilen ince bir çubuk kullanarak standart uygulamaları geliştirir, böylece komşu ciltlerden kontaminasyonu önler, ayrıca canlı organizmaların canlı ama kült olmayan mikropları canlandırmak ve nadir uygulanabilir mikroplar için zenginleştirmek amacıyla besin yoğun ortamlarında kısa kültürle zenginleştirilebileceği kavramını da önler.
Sonuçlar, göz çubuğu başına göreceli oküler kommensal bolluğu, konjonktiva yerleşik mikrobiyomu karakterize eder ve karşılaştırmalı amaçlar için önemlidir. Verilerimiz, cilt ve konjonktival mikrobiyota arasında bir fark olduğunu, ayrıca artan yaş ve bol miktarda cinsiyete özgü bir fark ile daha fazla çeşitlilik olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu yaklaşım tekrar tekrar nakavt farelerde övgüye yersiz farklılıklar buldu12. Bu protokol, kafes uygulamaları, coğrafya veya hastalık durumuna bağlı olarak değişebilen oküler mikrobiyomun yanı sıra kommensal metabolitlerin ve ürünlerin bağışıklık sistemi gelişimi ve yanıtı üzerindeki yerel etkilerini tanımlamak için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oküler yüzeyin paucibacterial durumu nedeniyle, birçok laboratuvar oküler commensals7,20izole etmektezorlandı,bu da büyüme, düşük bolluk ve düşük çeşitlilik ile düşük numune sayısına neden oldu8. Bu yöntem, bir zenginleştirme adımının yanı sıra MALDI-TOF MS tarafından yeniden tasarlanmış bir göz çubuğu ve tanımlaması eklenerek standart kültür uygulamaları4,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P30 DK034854’ten sağlanan finansman, Massachusetts Host-Microbiome Center’daki VY, LB ve çalışmaları ve NIH/NEI R01 EY022054’ten gelen fon MG’yi destekledi.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
- Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
- Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
- Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
- Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
- Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
- Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
- Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
- Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
- Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
- Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
- Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547 (2020).
- Johnson, T. R., Case, C. L. . Laboratory Experiments in Microbiology. , (2010).
- Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
- UK SMI. . Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , (2014).
- Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
- Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus–a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
- Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
- Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
- Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117 (2018).
- Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880 (2017).
- Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
- Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
- Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
- Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56 (2019).
- Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831 (2019).
- Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
- Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
- Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855 (2016).
- Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
- Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
- Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
- Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11 (2020).
- Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).
