Isolement et identification commensaux conjonctivaux chez la souris
Summary
Présenté ici est un protocole pour l’isolement et l’amplification des bactéries commensales conjonctivales anaérobies aérobies et facultatives de souris utilisant un écouvillon unique d’oeil et une étape basée sur culture d’enrichissement avec l’identification suivante par des méthodes basées microbiologiques et la spectrométrie de masse MALDI-TOF.
Abstract
La surface oculaire a été une fois considérée privilégiée et abiotique immunisée, mais récemment il s’affiche qu’il y ait une petite, mais persistante présence commensale. L’identification et la surveillance des espèces bactériennes au niveau de la muqueuse oculaire ont été difficiles en raison de leur faible abondance et de la disponibilité limitée de la méthodologie appropriée pour la croissance et l’identification commensales. Il existe deux approches standard : les méthodes de séquençage de l’ADN basées sur la culture ou les méthodes de séquençage de l’ADN. La première méthode est problématique en raison des bactéries récupérables limitées et la seconde approche identifie les bactéries vivantes et mortes conduisant à une représentation aberrante de l’espace oculaire. Nous avons développé une méthode robuste et sensible pour l’isolement bactérien en nous appuyant sur des techniques de culture microbiologique standard. Il s’agit d’une technique basée sur un écouvillon, utilisant un écouvillon mince « en laboratoire » qui cible la conjonctive inférieure, suivi d’une étape d’amplification pour les genres aérobies et anaérobies facultatifs. Ce protocole nous a permis d’isoler et d’identifier des espèces conjonctivales telles que Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,etc. L’approche convient pour définir la diversité commensale chez les souris dans différentes conditions de maladie.
Introduction
Le but de ce protocole est d’améliorer l’isolement spécifique des microbes aérobies et anaérobies facultatifs viables et rares de la conjonctive oculaire pour caractériser le microbiome oculaire. Des études approfondies ont profilé les communautés muqueuses commensales sur la peau, l’intestin, les voies respiratoires et génitales et montrent que ces communautés influencent le développement du système immunitaire et la réponse1,2,3. Il a été démontré que les communautés commensales oculaires changent au cours de certaines pathologies, telles que la sécheresse oculaire4,le syndrome de Sjögren5 et le diabète6. Pourtant, la capacité de définir une communauté commensale de surface oculaire typique est entravée par leur abondance relativement faible par rapport aux autres sites muqueux6,7,8. Cela suscite une controverse sur l’existence d’un microbiome oculaire résident et, s’il existe, s’il diffère du microbiome cutané et, par conséquent, de son effet local sur le développement et la réponse du système immunitaire inné. Ce protocole peut aider à résoudre cette question.
Généralement, les approches pour définir la niche commensale oculaire sont basées sur des techniques de séquençage et de culture4,7,9. Le séquençage de l’ADNr 16 S et l’analyse BRISK7 montrent une plus grande diversité que les techniques basées sur la culture, mais sont incapables de faire la différence entre les microbes vivants et morts. Étant donné que la surface oculaire est hostile à de nombreux microbes en raison des propriétés antimicrobiennes du film lacryptique4 générant un large éventail de fragments d’ADN, les approches basées sur l’ADN détecteront ces artefacts qui peuvent biaiser les données vers l’identification des bactéries mortes en tant que commensaux résidents plutôt que contaminants. Il en résulte une identification et une caractérisation commensales aberrantes de l’espace oculaire comme étant plus élevées en abondance et en diversité microbles10. Il est donc difficile de définir le microbiome oculaire résident par des méthodes basées sur l’ADN. Considérant que les techniques standard basées sur la culture sont incapables de détecter les commensaux parce que la charge est trop faible11. Notre méthode améliore les pratiques standard en utilisant un écouvillon mince qui peut cibler la conjonctive, évitant ainsi la contamination de la peau voisine, ainsi que le concept selon lequel les organismes viables peuvent être enrichis par une brève culture dans des milieux denses en nutriments dans le but de ressusciter viable mais non cultivable, ainsi que d’enrichir pour les microbes viables rares.
Les résultats, l’abondance relative des commensaux oculaires par écouvillonnage oculaire, caractérisent le microbiome résident de la conjonctive et sont importants à des fins de comparaison. Nos données montrent qu’il y a une différence entre la peau et le microbiote conjonctival, ainsi qu’une plus grande diversité avec l’âge et une différence d’abondance spécifique au sexe. De plus, cette approche a permis de trouver de manière reproductible des différences commensales chez les souris knock-out12. Ce protocole peut être appliqué pour décrire le microbiome oculaire qui peut varier en raison des pratiques de mise en cage, de la géographie ou de l’état pathologique, ainsi que des effets locaux des métabolites et des produits commensaux sur le développement et la réponse du système immunitaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison de l’état paucibactérien de la surface oculaire, de nombreux laboratoires ont eu du mal à isoler les commensaux oculaires7,20,ce qui a entraîné un faible nombre d’échantillons avec croissance, une faible abondance et une faible diversité8. Ce procédé améliore significativement les pratiques de culture standard4,21 par l’ajout d’une étape d’enrichissem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de P30 DK034854 a soutenu VY, LB et des études dans le Massachusetts Host-Microbiome Center et le financement de NIH / NEI R01 EY022054 a soutenu MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
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