Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH
Summary
Enkeltmolekyle RNA fluorescens in situ hybridisering (smFISH) er en metode til præcist kvantificering niveauer og lokalisering af specifikke RNA’er på enkelt celleniveau. Her rapporterer vi vores validerede laboratorieprotokoller til vådbænkbehandling, billedbehandling og billedanalyse til kvantificering af enkeltcellede kvantificering af specifikke RNA’er.
Abstract
Gentransskription er en vigtig proces i cellebiologi, og giver cellerne mulighed for at fortolke og reagere på interne og eksterne signaler. Traditionelle bulkpopulationsmetoder (Northern blot, PCR og RNAseq), der måler mRNA-niveauer, mangler evnen til at give oplysninger om celle-til-celle variation i svar. Præcis enkeltcellet og allelic visualisering og kvantificering er mulig via enkeltmolekyleT RNA fluorescens in situ hybridisering (smFISH). RNA-FISH udføres ved at hybridisere mål-RNA’er med mærkede oligonukleotidsonder. Disse kan afbildes i mellem-/højoverførselsmetoder og giver gennem billedanalyserørledninger kvantitative data om både modne og spirende RNA’er, alle på enkeltcelleniveau. Fiksering, permeabilisering, hybridisering og billeddannelse trin er blevet optimeret i laboratoriet i mange år ved hjælp af modelsystemet beskrevet heri, hvilket resulterer i en vellykket og robust enkelt celle analyse af smFISH mærkning. Hovedformålet med prøveforberedelse og -behandling er at producere billeder af høj kvalitet, der er karakteriseret ved et højt signal-til-støj-forhold for at reducere falske positiver og give data, der er mere nøjagtige. Her præsenterer vi en protokol, der beskriver pipelinen fra prøveforberedelse til dataanalyse sammen med forslag og optimeringstrin til at skræddersy til specifikke prøver.
Introduction
Gentransskription og oversættelse er de to store processer, der er involveret i biologiens centrale dogme, der går fra DNA-sekvensen til RNA til protein1. I denne undersøgelse fokuserer vi på produktionen af messenger RNA (mRNA) under transskription. Det spirende RNA-molekyle omfatter både ikke-kodende introner og kodnings exoner. Introns er co-transcriptionally splejset ud, før mRNA bevæger sig ind i cytoplasma til oversættelse på ribosomer2,3.
Traditionelt er målingen af mRNA udføres i bulk populationer af celler (hundreder til millioner) med klassiske assays såsom RT-qPCR eller nordlige blotting. Mens meget kraftfuld, disse metoder er begrænsede, da de ikke giver indsigt i celle-til-celle variation (fænotypisk heterogenitet), identifikation af antallet af transcriptionally aktive alleler, og måske endnu vigtigere, mangler rumlige oplysninger. For nylig, genom bred teknologier giver mulighed for enkelt celle RNA sekventering (RNAseq) begyndte at bygge bro mellem billeddannelse metoder og sekventering4. RNAseq lider imidlertid af relativt lav detektionseffektivitet , og behandlingstrinnene resulterer i fuldstændigt tab af geografisk information5. Selv om enkeltcellet RNAseq kan give indsigt i fænotypisk heterogenitet blandt en population af isogene celler, kan RNA fluorescens in situ hybridisering (RNA-FISH) lette en mere fuldstændig udforskning af målgenekspression på rumligt niveau og på allele-by-allele-basis6,7.
RNA FISH er en teknik, der giver mulighed for påvisning og lokalisering af mål RNA molekyler i faste celler. I modsætning til tidligere, besværlige metoder, nuværende state-of-the-art RNA-FISH udnytter kommercielt tilgængelige nukleinsyre sonder, der supplerer målet RNA sekvenser, og disse sonder hybridisere til deres mål ved Watson-Crick base parring8. De tidlige in situ hybridisering teknikker involveret en lignende protokol etableret af Gall og Pardue i 1969, som en prøve blev behandlet med nukleinsyre sonder, der specifikt hybridiseret til et mål RNA9. Oprindeligt blev analysen udført ved hjælp af radioaktiv eller farvemetrisk detektion; Men i 1980’erne, udviklingen af fluorescens in situ hybridisering (FISH) protokoller til DNA FISH og senere RNA FISH åbnede ruten mod mere følsom påvisning, og potentialet for multiplexing10,11.
Yderligere udviklinger inden for RNA FISH har ført til evnen til at detektere og kvantificere enkelte RNA-molekyler (smFISH)12,13. Direkte detektion er en metode, hvor sonderne selv er mærket med fluorophorer. En udfordring med smFISH er, at der er behov for nok hybridiserende sonder / mål til at lette påvisning af fluorescerende signaler som forskellige, diffraktion-begrænsede pletter. For at løse dette problem kan man bruge et sondesæt af korte enkeltstrengede DNA-oligonukleotider, der supplerer forskellige regioner i målet RNA8,12,14. Bindingen af flere sonder øger den lokale fluorophoretæthed, hvilket gør RNA synlig som et særskilt, højintensivt sted ved fluorescensmikroskopi. Denne metode er fordelagtig, fordi off-target binding af oligonukleotider i sonde sæt pool kan skelnes fra den sande RNA spot signal ved kvantitativt at analysere spot størrelse og intensitet til at skelne mellem ægte signal og falske oligonukleotid bindende, hvilket letter mere præcis analyse ved at reducere falske positiver12.
Alternative metoder til at opdage mRNA er den klassiske BAC klon-baserede nick oversættelse metode og de nyere udviklede forgrenede DNA-system. I BAC-klonede, nick-oversættelse metode, DNA, der skal mærkes er enzymatisk-nicked og en ny nukleotid føjes til den udsatte 3 ‘ende. Aktiviteten af DNA polymerase I tilføjer en mærket nukleotid resulterer i den ønskede sonde15,16. Den forgrenede DNA-teknik involverer oligonukleotidsonder, der hybridiserer parvis til RNA-mål, og disse sonder forstærkes ved hjælp af flere signalforstærkningsmolekyler. Denne metode kan forbedre signal-støj-forholdet betydeligt, men forstærkningen kan skævvride nøjagtig kvantitet, da fluorescerende pletter kan være vildt forskellige i størrelse og intensitet17.
Som et modelsystem for denne protokol, som er fuldt anvendt som en del af NIEHS Superfund Research Program deltagelse til at kvantificere virkningerne af hormonforstyrrende kemikalier i Galveston Bay / Houston Ship Channel, vi brugte østrogen receptor (ER) positiv brystkræft cellelinje MCF-7 behandlet natten over med en ER agonist, 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 regulerer mange ER-target gener, herunder prototypiske ER-target gen, GREB17,20,21,22. SmFISH-protokollen, der er beskrevet her, bruger et sæt af to spektralt adskilte sondesæt rettet mod GREB1; den ene, der hybridiserer til exons og den anden til introns, giver mulighed for måling af både modne og spirende RNA7. Vi bruger derefter epifluorescencemikroskopi kombineret med dekonvolution til billede smFISH-mærkede prøver og anvender derefter billedanalyserutiner for at kvantificere antallet af aktive alleler og modne RNA’er pr. Celle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne smFISH-metode er baseret på tidligere offentliggjorte protokoller7,12,14. I denne protokol forklarer vi de kritiske trin, der blev optimeret fra vådlaboratoriet (herunder såningstæthed, fikseringstid, permeabilisering og sondekoncentration), til billeddannelse og billedanalyse, hvilket giver en fuld eksperimentel pipeline til laboratorier, der er interesseret i at udføre enkeltcelleanalyse af gentransskription…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MAM, FS og MGM er finansieret af NIEHS (Projekt 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM og PKS understøttes af det CPRIT-finansierede GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719). Imaging understøttes også af Integrated Microscopy Core på Baylor College of Medicine med støtte fra NIH (DK56338 og CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center og John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
References
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
- Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
- Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
- Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
- Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
- Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
- Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
- Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
- Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
- Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
- Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
- Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
- Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
- Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
- Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
- Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
- Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).
