Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH
Summary
Флуоресценция одномолекулярной РНК in situ гибридизация (smFISH) представляет собой метод точной количественной оценки уровней и локализации конкретных РНК на уровне одной клетки. Здесь мы сообщаем о наших проверенных лабораторных протоколах для обработки мокрого стенда, визуализации и анализа изображений для количественной оценки одной клетки конкретных РНК.
Abstract
Транскрипция генов является важным процессом в клеточной биологии и позволяет клеткам интерпретировать и реагировать на внутренние и внешние сигналы. Традиционные методы массовой популяции (Northern blot, PCR и RNAseq), которые измеряют уровни мРНК, не способны предоставлять информацию о межклеточных вариациях в ответах. Точная одноклеточная и аллеличная визуализация и количественная оценка возможны с помощью флуоресценции in situ одной молекулы РНК (smFISH). РНК-FISH выполняется путем гибридизации целевых РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами. Они могут быть визуальзированы в модальностях со средней / высокой пропускной способностью и, с помощью конвейеров анализа изображений, предоставляют количественные данные как о зрелых, так и о зарождающихся РНК, все на уровне одной клетки. Этапы фиксации, пермеабилизации, гибридизации и визуализации были оптимизированы в лаборатории в течение многих лет с использованием описанной здесь модельной системы, что приводит к успешному и надежному одноклеточному анализу маркировки smFISH. Основной целью подготовки и обработки образцов является получение высококачественных изображений, характеризующихся высоким отношением сигнал/шум, для уменьшения ложных срабатываний и предоставления более точных данных. Здесь мы представляем протокол, описывающий конвейер от подготовки образцов до анализа данных в сочетании с предложениями и шагами оптимизации для адаптации к конкретным образцам.
Introduction
Транскрипция и трансляция генов являются двумя основными процессами, участвующими в центральной догме биологии, идущими от последовательности ДНК к РНК и белку1. В этом исследовании мы фокусируемся на производстве матричной РНК (мРНК) во время транскрипции. Зарождающаяся молекула РНК включает в себя как некодирующие интроны, так и кодирующие экзоны. Интроны совместно транскрипционно сращиваются до того, как мРНК перемещается в цитоплазму для трансляции на рибосомах2,3.
Традиционно измерение мРНК выполняется в объемных популяциях клеток (от сотен до миллионов) с помощью классических анализов, таких как RT-qPCR или Северное пятно. Несмотря на высокую мощность, эти методы ограничены, поскольку они не дают представления о вариации между клетками (фенотипическая гетерогенность), идентификации числа транскрипционно активных аллелей и, что, возможно, более важно, недостатке пространственной информации. Совсем недавно геномные технологии, позволяющие секвенировать одноклеточную РНК (RNAseq), начали преодолевать разрыв между методами визуализации и секвенированием4. Однако RNAseq страдает от относительно низкой эффективности обнаружения, и этапы обработки приводят к полной потере пространственной информации5. Хотя одноклеточный RNAseq может дать представление о фенотипической гетерогенности среди популяции изогенных клеток, флуоресценция РНК in situ гибридизация (RNA-FISH) может способствовать более полному исследованию экспрессии генов-мишеней на пространственном уровне и на аллельно-аллельнойоснове 6,7.
РНК FISH – это метод, который позволяет обнаруживать и локализовать молекулы-мишени РНК в фиксированных клетках. В отличие от более ранних, трудоемких методов, современные современные РНК-FISH используют коммерчески доступные зонды нуклеиновых кислот, которые дополняют целевые последовательности РНК, и эти зонды гибридизуются со своими целями путем спаривания оснований Уотсона-Крика8. Ранние методы гибридизации in situ включали аналогичный протокол, установленный Галлом и Пардью в 1969 году, когда образец обрабатывался зондами нуклеиновых кислот, которые специфически гибридизировались с целевой РНК9. Первоначально анализ проводился с использованием радиоактивного или колориметрического обнаружения; однако в 1980-х годах разработка протоколов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) к ДНК FISH и более поздним РНК FISH открыла путь к более чувствительному обнаружению и потенциалу мультиплексирования10,11.
Дальнейшие разработки в области РНК FISH привели к способности обнаруживать и количественно определять отдельные молекулы РНК (smFISH)12,13. Прямое обнаружение — это метод, при котором сами зонды маркируются флуорофорами. Проблема с smFISH заключается в том, что существует потребность в достаточном количестве гибридизирующих зондов/мишеней для облегчения обнаружения флуоресцентных сигналов в виде отдельных, ограниченных дифракцией пятен. Для решения этой проблемы можно использовать зондовый набор коротких одноцепочечных олигонуклеотидов ДНК, комплементарных различным областям целевой РНК8,12,14. Связывание нескольких зондов увеличивает локальную плотность флуорофора, делая РНК видимой как отдельное пятно высокой интенсивности с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод является преимуществом, поскольку внецелевое связывание олигонуклеотидов в пуле зондовых наборов может быть отличимо от истинного сигнала пятна РНК путем количественного анализа размера и интенсивности пятна для дифференциации истинного сигнала и ложного связывания олигонуклеотидов, что облегчает более точный анализ за счет снижения ложных срабатываний12.
Альтернативными методами обнаружения мРНК являются классический метод трансляции ника на основе клонов BAC и недавно разработанная разветвленная система ДНК. В методе BAC-клонированной трансляции ника ДНК, которая должна быть помечена, ферментарно проклинируется, и новый нуклеотид добавляется к экспонированной 3′-концу. К активности ДНК-полимеразы I добавляет меченый нуклеотид, в результате чего получается нужный зонд15,16. Метод разветвленная ДНК включает в себя олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются парами с мишенями РНК, и эти зонды усиливаются с использованием нескольких молекул амплификации сигнала. Этот метод может значительно улучшить отношение сигнал/шум, но усиление может исказить точное количественное определение, поскольку флуоресцентные пятна могут сильно различаться по размеру и интенсивности17.
В качестве модельной системы для этого протокола, которая полностью используется в рамках участия в исследовательской программе NIEHS Superfund для количественной оценки воздействия химических веществ, разрушающих эндокринную систему, в судоходном канале Галвестон-Бей / Хьюстон, мы использовали эстрогенный рецептор (ER) положительный клеточный ряд рака молочной железы MCF-7, обработанный в течение ночи агонистом ER, 17β-эстрадиолом (E2)7,18,19. E2 регулирует многие гены ER-мишени, включая прототипный ген ER-мишени, GREB17,20,21,22. Протокол smFISH, описанный здесь, использует набор из двух спектрально разделенных наборов зондов, нацеленных на GREB1; один из них гибридизуется с экзонами, а другой с интронами, что позволяет измерять как зрелую, так и зарождающуюся РНК7. Затем мы используем эпифлуоресцентную микроскопию в сочетании с деконволюцией для изображения образцов, помеченных smFISH, а затем применяем процедуры анализа изображений для количественной оценки количества активных аллелей и зрелых РНК на клетку.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанная методология smFISH основана наранееопубликованных протоколах7,12,14. В этом протоколе мы объясняем критические шаги, которые были оптимизированы от влажной лаборатории (включая плотность посева, время фиксации, пермеабилизацию ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
МАМ, ФУ и МГМ финансируются НИОС (Проект 4, P42ES027704, PI, Русин). MAM, FS, RMM, MGM и PKS поддерживаются финансируемым CPRIT Центром усовершенствованной микроскопии и информатики изображений GCC (RP170719). Визуализация также поддерживается интегрированным микроскопическим ядром в Медицинском колледже Бейлора при финансировании NIH (DK56338 и CA125123), CPRIT (RP150578), Комплексного онкологического центра Дэна Л. Дункана и Консорциума Джона С. Данна по химической геномике побережья Мексиканского залива.
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
References
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
- Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
- Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
- Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
- Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
- Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
- Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
- Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
- Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
- Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
- Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
- Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
- Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
- Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
- Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
- Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
- Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).
