Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola
Summary
L’ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l’elaborazione a banco umido, l’imaging e l’analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.
Abstract
La trascrizione genica è un processo essenziale nella biologia cellulare e consente alle cellule di interpretare e rispondere a segnali interni ed esterni. I metodi tradizionali di popolazione di massa (Northern blot, PCR e RNAseq) che misurano i livelli di mRNA non hanno la capacità di fornire informazioni sulla variazione da cellula a cellula nelle risposte. La visualizzazione e la quantificazione precisa di singole cellule e alleliche è possibile tramite ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH). RNA-FISH viene eseguito ibridando RNA bersaglio con sonde oligonucleotidiche marcate. Questi possono essere ripresi in modalità di throughput medio/alto e, attraverso pipeline di analisi delle immagini, forniscono dati quantitativi su RNA sia maturi che nascenti, il tutto a livello di singola cellula. Le fasi di fissazione, permeabilizzazione, ibridazione e imaging sono state ottimizzate in laboratorio per molti anni utilizzando il sistema modello qui descritto, che si traduce in un’analisi a cella singola di successo e robusta dell’etichettatura smFISH. L’obiettivo principale con la preparazione e l’elaborazione dei campioni è quello di produrre immagini di alta qualità caratterizzate da un elevato rapporto segnale-rumore per ridurre i falsi positivi e fornire dati più accurati. Qui presentiamo un protocollo che descrive la pipeline dalla preparazione del campione all’analisi dei dati in combinazione con suggerimenti e passaggi di ottimizzazione da adattare a campioni specifici.
Introduction
La trascrizione e la traduzione genica sono i due principali processi coinvolti nel dogma centrale della biologia, che vanno dalla sequenza del DNA all’RNA alla proteina1. In questo studio, ci concentriamo sulla produzione di RNA messaggero (mRNA) durante la trascrizione. La nascente molecola di RNA comprende sia introni non codificanti che esoni codificanti. Gli introni vengono splicati co-trascrizionalmente prima che l’mRNA si muova nel citoplasma per la traduzione sui ribosomi2,3.
Tradizionalmente, la misurazione dell’mRNA viene eseguita in popolazioni di massa di cellule (da centinaia a milioni) con saggi classici come RT-qPCR o Northern blotting. Sebbene molto potenti, questi metodi sono limitati in quanto non forniscono informazioni sulla variazione da cellula a cellula (eterogeneità fenotipica), sull’identificazione del numero di alleli trascrizionalmente attivi e, forse ancora più importante, mancano di informazioni spaziali. Più recentemente, le tecnologie a livello di genoma che consentono il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (RNAseq) hanno iniziato a colmare il divario tra i metodi di imaging e il sequenziamento4. Tuttavia, RNAseq soffre di efficienze di rilevamento relativamente basse e le fasi di elaborazione comportano la completa perdita di informazioni spaziali5. Sebbene l’RNAseq a singola cellula possa fornire informazioni sull’eterogeneità fenotipica tra una popolazione di cellule isogeniche, l’ibridazione in situ a fluorescenza dell’RNA (RNA-FISH) può facilitare un’esplorazione più completa dell’espressione genica bersaglio a livello spaziale e su base allele-per-allele6,7.
RNA FISH è una tecnica che consente il rilevamento e la localizzazione di molecole di RNA bersaglio in cellule fisse. A differenza dei metodi precedenti e laboriosi, l’attuale RNA-FISH all’avanguardia utilizza sonde di acidi nucleici disponibili in commercio che sono complementari alle sequenze di RNA bersaglio e queste sonde si ibridano ai loro bersagli mediante l’accoppiamento di basi Watson-Crick8. Le prime tecniche di ibridazione in situ hanno coinvolto un protocollo simile stabilito da Gall e Pardue nel 1969, poiché un campione è stato elaborato con sonde di acido nucleico che si sono specificamente ibridate a un RNAbersaglio 9. Originariamente il test è stato eseguito utilizzando la rilevazione radioattiva o colorimetrica; tuttavia, nel 1980, lo sviluppo di protocolli di ibridazione fluorescente in situ (FISH) a DNA FISH e successivamente RNA FISH ha aperto la strada verso il rilevamento più sensibile e il potenziale per il multiplexing10,11.
Ulteriori sviluppi nell’RNA FISH hanno portato alla capacità di rilevare e quantificare singole molecole di RNA (smFISH)12,13. Il rilevamento diretto è un metodo in cui le sonde stesse sono etichettate con fluorofori. Una sfida con smFISH è che c’è bisogno di abbastanza sonde / bersaglio ibridanti per facilitare il rilevamento di segnali fluorescenti come punti distinti e limitati dalla diffrazione. Per affrontare questo problema, si può usare un set di sonde di oligonucleotidi di DNA a singolo filamento brevi complementari a varie regioni dell’RNA bersaglio8,12,14. Il legame di più sonde aumenta la densità del fluoroforo locale, rendendo l’RNA visibile come un punto distinto ad alta intensità mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo è vantaggioso perché il legame off-target degli oligonucleotidi nel pool del set di sonde può essere distinto dal vero segnale spot dell’RNA analizzando quantitativamente la dimensione e l’intensità dello spot per distinguere tra segnale reale e legame oligonucleotidico spurio, facilitando così un’analisi più accurata riducendo i falsi positivi12.
Metodi alternativi per rilevare l’mRNA sono il classico metodo di traduzione nick basato su clone BAC e il sistema di DNA ramificato di più recente sviluppo. Nel metodo di traduzione nick clonato con BAC, il DNA da etichettare viene inciso enzimaticamente e un nuovo nucleotide viene aggiunto all’estremità esposta di 3′. L’attività della DNA polimerasi I aggiunge un nucleotide etichettato risultando nella sonda desiderata15,16. La tecnica del DNA ramificato coinvolge sonde oligonucleotidiche che si ibridano in coppie a bersagli di RNA e queste sonde sono amplificate utilizzando più molecole di amplificazione del segnale. Questo metodo può migliorare significativamente il rapporto segnale-rumore, ma l’amplificazione può distorcere la quantificazione accurata poiché i punti fluorescenti possono essere molto diversi per dimensioni e intensità17.
Come sistema modello per questo protocollo, che è pienamente impiegato come parte della partecipazione al NIEHS Superfund Research Program per quantificare gli effetti delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino a Galveston Bay / Houston Ship Channel, abbiamo utilizzato la linea cellulare positiva al cancro al seno del recettore degli estrogeni (ER) MCF-7 trattata durante la notte con un agonista ER, 17β-estradiolo (E2)7,18,19. E2 regola molti geni bersaglio ER, tra cui il prototipo del gene bersaglio ER, GREB17,20,21,22. Il protocollo smFISH qui descritto utilizza un set di due set di sonde separati spettralmente mirati a GREB1; uno che si ibrida agli esoni e l’altro agli introni, consentendo la misurazione dell’RNA7sia maturo che nascente. Usiamo quindi la microscopia a epifluorescenza accoppiata con la deconvoluzione per l’immagine di campioni etichettati smFISH e quindi applichiamo routine di analisi delle immagini per quantificare il numero di alleli attivi e RNA maturi per cellula.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodologia smFISH descritta si basa sui protocolli7,12,14precedentemente pubblicati. In questo protocollo, spieghiamo i passaggi critici che sono stati ottimizzati dal wet-lab (tra cui densità di semina, tempo di fissazione, permeabilizzazione e concentrazione della sonda), all’imaging e all’analisi delle immagini, fornendo una pipeline sperimentale completa per i laboratori interessati a eseguire analisi a singola cellula …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MAM, FS e MGM sono finanziati da NIEHS (Progetto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM e PKS sono supportati dal GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719), finanziato dal CPRIT. L’imaging è anche supportato dall’Integrated Microscopy Core presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti da NIH (DK56338 e CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center e John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
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