Summary
단일 분자 RNA 형광은 시투 혼성화(smFISH)에서 단일 세포 수준에서 특정 RNA의 수준 및 국소화를 정확하게 정량화하는 방법이다. 여기서는 특정 RNA의 단일 세포 정량화를 위한 습식 벤치 처리, 이미징 및 이미지 분석을 위한 검증된 실험실 프로토콜을 보고합니다.
Abstract
유전자 전사는 세포 생물학에 필수적인 프로세스이고, 세포가 내부 및 외부 단서를 해석하고 반응할 수 있습니다. mRNA 수준을 측정하는 전통적인 벌크 인구 방법 (북부 얼룩, PCR 및 RNAeq)는 반응에 있는 세포 대 세포 변이에 정보를 제공하는 기능이 부족합니다. 정확한 단일 세포 및 동종 가시화 및 정량화는 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 RNA 형광을 통해 가능하다. RNA-FISH는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 가진 표적 RNA를 혼성화하여 수행됩니다. 이들은 중간/고 처리량 양식으로 이미지될 수 있으며, 이미지 분석 파이프라인을 통해 성숙및 초기 RNA 모두에 대한 정량적 데이터를 단일 셀 수준에서 제공할 수 있습니다. 고정, 투과성, 혼성화 및 이미징 단계는 여기에 설명된 모델 시스템을 사용하여 수년 동안 실험실에서 최적화되어 왔으며, 이로 인해 smFISH 라벨링의 성공적이고 견고한 단일 셀 분석이 초래됩니다. 샘플 준비 및 처리의 주요 목표는 높은 신호 대 잡음 비율을 특징으로 하는 고품질 이미지를 생성하여 거짓 긍정을 줄이고 보다 정확한 데이터를 제공하는 것입니다. 여기서는 특정 샘플에 맞게 조정하기 위한 제안 및 최적화 단계와 함께 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르는 파이프라인을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.
Introduction
유전자 전사 및 번역은 DNA 서열에서 RNA로 단백질 1로 가는 생물학의 중앙 교리에 관여하는 2개의 중요한프로세스입니다. 이 연구에서는 전사 중에 메신저 RNA (mRNA)의 생산에 중점을 둡니다. 초기 RNA 분자는 비 코딩 인트론과 코딩 엑손을 모두 포함한다. 인트론은 mRNA가 리보솜2,3에서번역을 위해 세포질로 이동하기 전에 공동 전사적으로 접합된다.
전통적으로, mRNA의 측정은 RT-qPCR 또는 북부 블로팅과 같은 고전적인 소사와 세포의 대량 인구 (수억)에서 수행됩니다. 매우 강력하지만, 이러한 방법은 세포 간 변이(phenotypic 이질성), 전사 활성 적 진상화 수의 식별, 그리고 아마도 더 중요한 것은 공간 정보가 부족하기 때문에 제한적입니다. 최근에는 단세포 RNA 염기서열분석(RNA)을 허용하는 게놈 와이드 기술이 이미징 방법과 시퀀싱4사이의 격차를 해소하기 시작했다. 그러나, RNAseq는 상대적으로 낮은 검출 효율성으로 고통받고 처리 단계는 공간 정보의 완전한 손실을초래5. 단하나 세포 RNAEq는 동종 세포의 인구 들 사이에서 표현성 이질성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 시투 혼성화 (RNA-FISH)에서 RNA 형광은 공간 수준에서 표적 유전자 발현의 보다 완전한 탐구를 용이하게 할 수 있으며, 골자별 기준6,7.
RNA FISH는 고정 된 세포에서 표적 RNA 분자의 검출 및 국소화를 허용하는 기술이다. 이전, 고된 방법과 는 달리, 현재의 최첨단 RNA-FISH는 표적 RNA 서열에 상보적인 상업적으로 이용가능한 핵산 프로브를 이용하고, 이들 프로브는 왓슨 크릭 베이스 페어링8에의해 그들의 표적에 혼성화된다. 초기 시투 혼성화 기술은 1969년에 Gall 및 Pardue에 의해 확립된 유사한 프로토콜을 포함했으며, 시료는 표적 RNA9에특별히 혼성화된 핵산 프로브로 처리되었다. 원래 분석은 방사성 또는 색탐지를 사용하여 수행되었다; 그러나, 1980년대에, DNA FISH 및 이후 RNA FISH에 대한 시투 혼성화(FISH) 프로토콜의 형광개발은 보다 민감한 검출을 향한 경로를 열어,10,11을멀티플렉스화할 수 있는 가능성을 열어놓았다.
RNA FISH의 추가 발달은 단일 RNA 분자(smFISH)12,13을검출하고 정량화하는 능력을 주도하였다. 직접 검출은 프로브 자체가 형광으로 표시되는 방법입니다. smFISH의 과제는 형광 신호의 검출을 구별되는 회절 제한 반점으로 쉽게 감지할 수 있는 충분한 혼성 화 프로브/대상이 필요하다는 것입니다. 이 문제를 해결하기 위해,표적 RNA8,12,14의다양한 부위에 보편화된 짧은 단하나 좌초 DNA 올리고뉴클레오티드의 프로브 세트를 사용할 수 있다. 여러 프로브의 결합은 국소 형광 밀도를 증가시켜 RNA를 형광 현미경 검사법에 의한 뚜렷한 고강도 지점으로 볼 수 있게 합니다. 이 방법은 프로브 세트 풀에서 올리고뉴클레오티드의 오프타겟 결합이 실제 신호와 스퓨리어스 올리고뉴클레오티드 결합을 구별하기 위해 스팟 크기와 강도를 정량적으로 분석함으로써 진정한 RNA 스팟 신호와 구별될 수 있기 때문에 유리하다12.
mRNA를 검출하는 대체 방법은 고전적인 BAC 클론 기반닉 번역 방법 및 최근에 개발된 분기 DNA 시스템이다. BAC-복제, 닉 번역 방법에서, 표지되는 DNA는 효소-별명이 있고 새로운 뉴클레오티드가 노출된 3'끝에 추가된다. DNA 중합체의 활성은 원하는프로브(15,16)의결과로 표지된 뉴클레오티드를 추가한다. 분지 된 DNA 기술은 RNA 표적에 쌍으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하고 이 프로브는 다중 신호 증폭 분자를 사용하여 증폭된다. 이 방법은 신호 대 잡음 비율을 크게 향상시킬 수 있지만 형광 반점이 크기와강도(17)에서격렬하게 다를 수 있기 때문에 증폭이 정확한 수량을 왜곡할 수 있다.
이 프로토콜의 모델 시스템으로, 이는 칼리프 슈퍼펀드 연구 프로그램 참여의 일환으로 갤버스턴 베이/휴스턴 선박 채널에서 내분비 방해 화학물질의 효과를 정량화하기 위해, ER 작용제, 17β-estradiol(E2)7,18, 189로하룻밤 치료된 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 세포주 MCF-7을 사용하였다. E2는 프로토타입 ER 표적 유전자, GREB17,20,21,22를포함하는 많은 ER 표적유전자를조절한다. 여기에 설명된 smFISH 프로토콜은 GREB1을 대상으로 하는 두 개의 스펙트럼 분리 프로브 세트 세트를 활용합니다. 하나는 엑손과 다른 인트론에 혼성화하여 성숙하고 초기 RNA7을측정할 수 있게 한다. 그런 다음 에피플루오레이션 현미경 검사법을 사용하여 감쇠가 부착된 샘플을 이미지smFISH에 사용한 다음 이미지 분석 루틴을 적용하여 활성 알레및 성숙한 RNA의 수를 정량화합니다.
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Protocol
최적의 결과를 보장하기 위해 이 프로토콜의 습식 실험실 부분에는 모든 단계에서 표준 RNase 가 없는 주의해야 합니다. 예를 들어, 여과 된 파이펫 팁, 멸균 용기 및 RNase 가없는 버퍼의 사용은 매우 권장됩니다. 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체와 같은 RNase 억제제도 사용하며, 특히 낮은 풍부도 표적 RNA를 위해 제안된다.
1. 세포 배양 및 실험 설정
- Fhenol-red 무료 (호르몬 자극 실험에만 필요) 덜벡코의 수정 된 독수리의 매체 (DMEM)와 T75 조직 배양 플라스크에서 준수 MCF-7 유방암 세포 (ATCC #HTB-22)를 유지 10% 태아 소 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 2 mM L-glutamine, 1 nM 나트륨 피루바테, 50 I.U./mL 페니실린 및 50 μg/mL 연쇄 절제술.
- 산에 새겨진 폴리 D-리신 코팅 둥근 커버립(0.16 ~ 0.19 mm 두께, 12mm 직경)을 24개의 멀티웰 조직 배양 플레이트에 넣습니다.
참고: 표준 프로토콜에 따라 멸균 PBS(Ca++ 및 Mg++)로재구성된 폴리 D-lysine의 1 mg/mL 용액으로 커버립과 코트를 산에 식히기 위해 1 M HCl을 사용합니다. - 세포에서 성장 매체를 제거하고 멸균 PBS (Ca++ 및 Mg++없이 인산염 완충식식염)로 한 번 세척하십시오. 트립신-EDTA 0.25% 용액의 2-3 mL를 사용하여 MCF-7 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 동일한 양의 성장 매체로 트립신-EDTA 0.25% 용액을 중화시합니다.
- 미디어 서스펜션의 세포를 15mL 원상 튜브로 옮기고, 세포를 배출하기 위해 391 x g에서 1분 동안 회전합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 원문 관으로부터 미디어를 조심스럽게 제거하고 적절한 양의 치료 매체에서 세포를 다시 중단한다.
참고: 치료 매체는 페놀 레드 프리 DMEM5% 숯-dextran 박탈 및 투석 FBS, 2m L-글루타민, 1 nM 나트륨 피루바테, 50 I.U./mL 페니실린 및 50 μg/mL 연쇄 절제술로 보충됩니다. 이 매체는 혈청 성분이 주로 미디어를 제거 숯에 의해 스테로이드의 고갈으로 스테로이드 호르몬 자극 실험에 필수적이다, 투석을 통해 성장 인자를 감소. - 500 μL의 처리 매체에서 잘 당 60,000에서 70,000 세포에서 24 멀티웰 플레이트에서 커버립에 세포를 시드. 이 실험을 위해, 세포 합류는 처리 개시시 약 70-80%이어야 합니다. 세포 유형, 성장 속도 및 실험 의 길이에 따라 세포 파종 밀도를 최적화하여 연결성을 방지하여 이미지 분석을 복잡하게 만듭니다.
참고: 최상의 이미징 및 이미지 분석을 위해 세포 응집을 피하십시오. 이를 위해, 우물에 분배하기 전에 세포를 파이프팅(또는 잠시 소용돌이)하여 세포의 알리쿼트(aliquot)를 철저히 섞는다. 도금 된 세포를 인큐베이터에 다시 넣기 전에 세포가 조직 배양 후드에 약 20 분 동안 정착하게하면 세포 응집을 줄이는 데 도움이됩니다. - 성장 매체의 박탈/투석혈에 남아 있는 임의의 신호 분자로 인해 세포 주기 동기화 및 배경 감소를 보장하기 위하여 처리의 앞에 적어도 이틀 동안 세포를 배양합니다.
- 치료 매체에서 48시간 배양 후, MCF-7 세포를 10nM 17β-estradiol(E2) 및 차량 제어(DMSO)로 24시간 동안 치료 매체에 희석시 치료한다. 이 치료는 최대 반응을 유도 하기 위해 E2의 포화 복용량을 사용 하 여. 다른 표적 유전자, 세포 모델 및 치료 유형에 대한 조건을 경험적으로 결정하기 위해 시간 과정 및 용량 반응 실험을 수행하십시오. 예를 들어 최근 간행물7을참조하십시오.
2. 버퍼 준비
- 고정 버퍼를 준비하려면 정제된 단황 포름알데히드(전자 현미경 공급업체가 16% 파라포름알데히드로 판매)에서 멸균 PBS Ca++/Mg ++(인산염 완충식식염플러스 Ca+++ Mg+++)에서 4%로 희석합니다. 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체(VRC)를 고정 버퍼에 추가하여 RNA 분해를 지연시키는 2mM의 최종 농도를 가한다.
- 24 멀티웰 플레이트의 웰당 고정300-500 μL을 요구하여 고정 버퍼의 총 양을 계산합니다. 고정 단계에서 필요할 때까지 4% 포름알데히드를 얼음 위에 보관합니다.
참고: 각 실험에 대해 고정 버퍼를 새로 만듭니다.
주의: 포름알데히드는 피부를 통해 흡수되는 테라토겐입니다. 이 화학 물질을 기관 규정에 따라 적절한 PPE와 함께 연기 후드에 사용하십시오.
- 24 멀티웰 플레이트의 웰당 고정300-500 μL을 요구하여 고정 버퍼의 총 양을 계산합니다. 고정 단계에서 필요할 때까지 4% 포름알데히드를 얼음 위에 보관합니다.
- 투과성 단계의 경우 뉴클레아제 프리 워터에서 70% 에탄올을 준비한다. 대체 옵션은 멸균 PBS Ca++/Mg++ VRC 2mM의 트리톤 X100 0.5% 트리톤-X100입니다. 우물당 500μL의 버퍼를 활용하여 필요한 총 충류 버퍼를 계산합니다.
- 혼성화 완충제의 9mL을 준비하려면, 2mL의 스톡 50% dextran 황산염, 20x SSC(식염수 질나트륨 구연산) 버퍼 1mL을 6mL의 뉴클레아제 프리 워터에 첨가한다. 소용돌이는 혼성화 버퍼를 철저히 혼합합니다. 이 버퍼는 최대 1주일 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
- 2배식식염수(SSC) 버퍼가 필요한 5개의 별도 세척 단계가 있습니다. 세척 단계당 커버슬립당 500μL의 버퍼를 예상하여 필요한 2배 SSC 버퍼의 최종 부피를 계산합니다. 핵이 없는 물에 필요한 양의 재고 20배 SSC 버퍼를 희석시. 2mM VRC를 추가하여 추가 예방 조치로 단계를 세척할 수 있습니다. 이 버퍼는 처리 단계의 기간 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.
3. RNA 물고기에 대한 고정
- 치료 후, 우물에서 미디어를 제거하고 멸균, 차가운 PBS Ca++/ Mg++한 번 세척. 낮은 준수 세포 모델이 사용되는 경우, 액체를 흡인하기 위해 진공을 사용하지 마십시오. 수동 파이펫을 사용하여 우물 의 측면에서 미디어를 조심스럽게 제거하고 초기 세척 단계를 생략하십시오. 얼음 위에 30분 동안 500 μL 고정 버퍼를 추가합니다.
참고: 시료가 RNA 분해되기 쉬운 경우 이 시점에서 세척 단계에 2mM VRC가 있는 멸균 PBS를 사용하십시오. - 고정을 제거하고 제도적 규정에 따라 화학 폐기물에 폐기하십시오. 차가운 멸균 PBS Ca ++ /Mg+++로세포를 3분간 두 번 씻으십시오.
- PBS를 제거하고 각 우물에 70% 에탄올의 500 μL을 추가합니다. 파라핀 플라스틱 필름으로 24 개의 우물 판을 밀봉하십시오. 회전기에 4°C에서 최소 4시간 동안 놓습니다. 하룻밤 사이에 70%의 에탄올에 샘플을 두는 것이 가장 좋습니다. 프로토콜은 이 시점에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 70% 에탄올에서 최대 1주일 동안 저장할 수 있습니다.
참고: PBS의 0.5% Triton-X100은 2mM VRC 솔루션을 대체할 수 있습니다. 이 투과화 버퍼의 500 μL에서 회전자의 실온에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. 이 permeabilization 버퍼를 활용하는 경우 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 없으며 혼성화 단계를 통해 계속해야 합니다.
4. RNA 물고기에 대한 혼성화
- 투과성 버퍼를 제거하고 회전기의 실온에서 5분 동안 2x SSC 버퍼의 500 μL과 10% 포르미미드로 1회 세척합니다.
- 완전한 혼성화 버퍼를 준비합니다. 커버슬립당 완전한 혼성화 버퍼약 30μL를 계산합니다. 하이브리드화 버퍼에 폼아미드를 추가하여 필요한 백분율에 도달합니다. 예를 들어, 완전한 혼성화 버퍼의 500 μL이 필요한 경우, 이전에 만들어진 혼성화 버퍼의 450 μL과 분자 등급 폼아미드의 50 μL으로 구성되어 10% vol/vol에 도달하게 됩니다. 소용돌이가 짧게 섞어.
주의: 포르마미드는 피부를 통해 흡수되는 테라토겐입니다. 기관 규정에 따라 적절한 PPE와 함께 연기 후드에이 화학 물질을 사용합니다. - GREB1 인트론(Atto 647N으로 레이블이 지정) 및 GREB1 엑손(Quasar 570으로 레이블) 프로브1:300을 혼성화 버퍼에서 희석시 희석시. 파이펫팅을 통해 섞으세요. 이 버퍼를 빛으로부터 보호하고 즉시 사용하십시오.
참고 : 프로브는 스토시 외7에상세한대로 설계 및 제조되었다. 프로브는 일반적으로 제조 업체 프로토콜(14)에따라 RNAse-free TE 버퍼로 재구성되어야하는 말린 올리고뉴클레오티드 프로브 풀로 제공됩니다. 따라서 이러한 프로브의 재고 용액은 12.5 μM이었습니다. 프로브의 작동 농도는 42 nM입니다. - 하룻밤 혼성화 단계를 위해 가습 챔버를 준비합니다. 노출되지 않은 파라핀 플라스틱 필름 조각을 표면 데쿤타미넌트로 청소한 유리 페트리 접시에 놓고 RNases를 제거합니다. 두 개의 종이 타월을 멸균물로 포화시키고 페트리 접시 가장자리를 따라 배치하여 건조가 특정 라벨링을 파괴할 수 있기 때문에 습도를 제공합니다.
- 파라핀 플라스틱 필름의 깨끗한 측면에 하이브리드화 버퍼에 프로브의 30 μL을 점팅하여 프로브를 알리쿼트합니다. 커버립이 서로 접촉하지 않도록 프로브의 알리쿼트를 배포합니다.
- 살균 된 집게를 사용하여, 부드럽게 유리 페트리 접시에 프로브에 커버립 셀 측면을 뒤집습니다. 기포를 피하고 커버립에 압력을 가하지 마십시오.
참고: 후속 단계에 필요한 대로 2x SSC 버퍼로 조직 배양 판을 버리지 마십시오. - 파라핀 플라스틱 필름으로 유리 페트리 접시를 밀봉하고 형광에 빛이 노출되는 것을 방지하기 위해 호일로 접시를 덮습니다. 평평한 비회전 표면에 37 °C에서 최대 16 시간 까지 하룻밤 동안 배양하십시오. 잠복기시간은 경험적으로 다양할 수 있지만 최소 4시간이 권장됩니다.
참고: 커버립은 혼성화 버퍼에서 배양할 때 미끄러지기 쉬어 커버슬립의 건조 한 반점과 시료를 손상시킬 수 있습니다.
5. 이미징용 샘플 준비
- 다음 날, 집게를 사용하여 가습 챔버에서 커버립을 제거하고 셀 측이 위로 24 우물 플레이트로 돌려놓습니다. 신선한 2x SSC 버퍼 500 μL과 10% 폼아미드를 추가하여 과도한 프로브와 비특이적 혼성화를 씻어냅니다.
참고: 이 시점부터 샘플을 빛으로부터 보호합니다. - 가열 된 회전기에서 각각 37 ° C에서 2 x SSC 버퍼500 μL과 10 % 포르마이드로 셀을 두 번 씻으하십시오.
- 2x SSC 버퍼에서 1 μg/mL에서 DAPI를 사용하는 카운터스테인 DNA는 회전기의 실온에서 10분 동안 완충합니다.
- 실온에서 2x SSC 버퍼로 1회 세척합니다.
- 커버립을 종이 타월로 2배 SSC 버퍼를 제거하고 핵자유수로 빠르게 세척하여 과도한 염을 제거한 후 경화되지 않는 마운팅 미디어를 사용하여 유리 슬라이드에 커버립을 장착합니다. 마지막으로, 명확한 매니큐어로 커버립을 밀봉.
6. 고해상도 현미경 검사및 이미지 처리
- 60x 또는 100x 오일 목표와 sCMOS 카메라를 사용하여 광야 피불화 현미경의 샘플을 이미지합니다. 이 실험에 사용되는 특정 현미경 및 목표에 대한 재료 테이블을 참조하십시오.
- 시료가 완전히 처리되는 즉시 완전한 이미징을 통해 신호의 시간 의존적 저하를 방지합니다.
참고: 굴절률(RI)이 1.516인 침수 오일이 이 실험에 사용된다. RI 불일치로 인해 이미지 감소에 영향을 주는 포인트 스프레드 함수의 수차가 발생하므로 오일 RI를 특정 샘플과 일치시키기 위해 경험적 테스트를 수행해야 합니다.
- 시료가 완전히 처리되는 즉시 완전한 이미징을 통해 신호의 시간 의존적 저하를 방지합니다.
- 이미지는 0.10827 μm의 측면 픽셀 크기로 캡처됩니다.
- 가장 높은 강도(즉, 양양성 컨트롤)를 가질 것으로 예상되는 시료를 사용하여 각 채널(DAPI, TRITC, CY5 필터)에 대한 광원(즉, 백분율 전송)과 노출 시간(DAPI, TRITC, CY5 필터)으로부터의 조명 양을 최적화합니다. 이 실험에서, E2 처리된 견본은 GREB1 프로브 세트 둘 다에 대해 더 높은 세기를 가질 것으로 예상됩니다. 일반적으로 GREB1 인트론 및 엑손 프로브의 백분율 전송은 50 ~ 100 %이며 노출 시간은 0.25 - 0.60 초 범위입니다.
- 또한 광표백 및/또는 카메라 픽셀의 채도를 방지하는 조건에서 이미지를 수집합니다. 우리의 경험에 따르면 배경과 신호 강도 사이에 최소 ~ 10 배 차이가 있어야합니다. 몇 픽셀/필드의 포화는 샘플의 비특이적 신호(즉, 커버슬립의 먼지, 셀 외부의 프로브 골재)로 인해 발생할 수 있지만 포화 영역이 수량에 포함되지 않은 경우에만 발생할 수 있습니다.
- z 스택의 인수를 설정하려면 DAPI 채널의 샘플에 초점을 맞춥니다. DAPI 염색 핵이 초점이 되는 거리에서 z 스택의 상단과 하단을 선택합니다. 우리가 사용한 z 스택 단계 크기는 슬라이스 당 0.25 μm이고 총 z 스택은 전체 셀 (MCF-7 셀에서 약 10 μm)에 걸쳐야합니다. 그러나 z 스택 단계 크기는 사용되는 목표에 따라 변경되며 나이퀴스트 샘플링 기준을 따라야 합니다.
참고: 인트론은 일반적으로 핵에만 존재합니다. 그러나, 엑소는 핵과 세포질에 둘 다 있습니다. 따라서, 전술한 바와 같이 z-스택을 설정하면 z-스택이 전체 셀을 포괄함에 따라 대부분의 인트론 및 엑손 라벨을 캡처합니다. - 전형적으로, 예비 실험에서 정량적 분석을 위한 최소 200개의 세포를 이미지하여 세포 간의 반응 및 변화의 크기의 스냅샷을 캡처한다.
- 일부 이미지 된 세포는 최종 분석에서 제외됩니다 (즉, 드롭 아웃 속도) 그들은 분석 파이프 라인에 의해 필터링될 것이기 때문에 (즉, 이미지의 테두리를 만지는 세포, 세포, 세포/ 소세포).
참고: 이미지 영역을 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 요소가 있습니다. DAPI 표지, 핵 형광에 의해 정의된 바와 같이 균일하게 퍼지는 비겹침 세포가 있는 지역을 선택합니다. 또한 부분 세포 수를 계산하지 않도록 이미지 영역의 가장자리를 따라 핵 수가 가장 적은 영역을 선택하십시오. 자동화되고 편견없는 이미징은 통계 적 분석을 필요로하는 실험에 항상 선호됩니다. - 수집 후 10사이클(예: 반복 횟수)을 사용하여 공격적인 복원 알고리즘을 사용하여 이미지를 데온볼브합니다. 이미지 분석을 위한 최대 강도 투영을 생성합니다(특정 3D 분석이 필요한 경우 이 단계를 생략하십시오). 사용된 카메라의 비트 깊이에 따라 모든 프로젝션 이미지를 저장합니다. 우리의 경우 16 비트 TIFF 그레이 스케일 이미지가 저장되었습니다. RGB 이미지는 비트 깊이가 감소하여 정보 손실이 발생합니다. 따라서 RGB 이미지는 이미지 분석에 적합하지 않습니다.
7. 이미지 분석
- 지침을 읽고 github(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis)에서jupyter 노트북을 다운로드합니다.
- 파이썬 아나콘다 배포(https://www.anaconda.com/distribution/)버전 3.6 이상 설치합니다.
- 아나콘다 프롬프트를 열고 설치 명령을 입력하여 아나콘다(https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk)에대한 간단한 ITK를 설치합니다.
- 아나콘다 네비게이터를 열고 주피터 노트북을 출시합니다. 디렉터리 및 파일을 보여주는 웹 브라우저를 엽니다. 디렉토리 구조를 탐색하여 github에서 다운로드한 주피터 노트북이 포함된 디렉토리에 도달합니다.
- 프림을 열고 시프트를 누르고 동시에 입력하여 각 셀을 실행합니다.
- 노트북에 제공된 각 기능 및 단계의 세부 사항을 따릅니다. 다른 이미지 집합의 경우 일부 매개 변수 값을 변경해야 할 수 있습니다.
참고: 간단히 말해서 핵은 블록 크기가 251픽셀인 로컬 임계값을 사용하여 DAPI 채널에서 분할되고 구멍이 채워지고 100픽셀 미만의 물체가 제거되었습니다. 터치 핵은 분수령 알고리즘을 사용하여 분할되었다. 핵 마스크는 100픽셀로 팽창하고 분수령을 사용하여 핵을 분지로 사용하여 접촉하는 물체를 분리하는 데 사용되었습니다. 정상 상태 RNA(엑슨)를 식별하기 위해 오츠 임계값이 사용되었습니다. 전사 활성 알레일(intron)의 경우, 먼저 가우시안 블러(sigma=1)가 적용된 다음 최대 엔트로피 임계값이 사용되었습니다.
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Representative Results
예를 들어, smFISH를 통한 호르몬 반응을 분석하기 위해, NIEHS 슈퍼펀드 연구 프로그램7에참여하는 맥락에서 환경재해에 내분비가 화학물질을 방해하는 내분비의 존재를 결정하기 위해 높은 처리량 분석에서 사용되는 에스트로겐 수용체(ER) 모델을 선택했다. 본 실험에서, 신봉성 MCF-7 유방암 세포는 ER 작용제 17β-estradiol (E2, 10 nM) 또는 차량(DMSO)으로 24시간 동안 치료되었다. GREB1 내성(아토 647N, 도 1의빨간색) 및 엑소닉(Quasar 570, 그림 1의녹색) 시퀀스를 상대로 분별 분리 프로브 세트는 초기 및 성숙한 mRNA의 동시 시각화 및 정량화를 허용합니다. 중요하게도, 에스트로겐 반응 시간 과정7의일부로 나타난 각 세포에서 전사 활성 적 진상화 의 수를 표시한다.
완성된 프로토콜은 관심 있는 각 영역에 대해 16비트 최대 강도 투영(TIFF)을 생성합니다. 핵 세분화는 DAPI 염색 핵을 사용하여 수행되며, 세포 경계는 핵 마스크를 확장하여 추정된다. GREB1 인트론 및 엑손 신호는 각 개별 셀에 분할되고 할당됩니다. 그림 1은 DMSO 및 E2로 처리된 샘플에 대한 최대 투영 이미지와 세분화를 표시합니다.
그림 1: smFISH 샘플 이미지 및 이미지 세분화의 출력. (A)MCF-7 세포는 24시간 동안 DMSO(왼쪽 패널) 및 17β-estradiol(E2, 오른쪽 패널)으로 처리되었으며, GREB1 인트론(Atto 647N, 초기 mRNA, 빨간색) 및 GREB1 엑손(Quasar 570, 성숙한 mRNA, 녹색)을 대상으로 혼성화되었다. 이미지는 60x/1.42NA, 데온프로이치 및 최대 강도 투영에서 획득됩니다. (B)으로부터의이미지는 핵 마스크를 정의하는 기술된 이미지 분석 파이프라인을 통해 처리되며, 셀룰러 마스크를 추정하며, 개별 성숙한 mRNA 및 전사 활성 항진을 식별한다. GREB1 인트론 및 엑손 반점은 개별 세포에 할당됩니다. 스케일 바: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영상분석 파이프라인에 이어, 치료당 10개의 무작위 필드를 이미징에 기초하여 영상 경계를 건드리지 않은 세포의 수를 얻었으며, 150개의 DMSO 처리세포와 149E2 처리된 세포가 있는 것으로 판단되었다. aneuploid MCF-7 세포는 GREB1 유전자의 4개의 사본을 가지고 있기 때문에, 인트론 및 엑손 프로브와 함께, 겹치는 신호는 활성 전사에 종사하는 알레및 세포의 수를결정합니다(24). 우리는 중첩 인트론과 엑손 반점을 계산하여 제로 - 투 - 4 활성 GREB1 알을 가진 각 치료에 대한 세포 인구의 분획을 결정했다. 이전 연구와 마찬가지로, 우리는 전사 활성 세포를 두 개 이상의 활성 GREB1 을 표시한 세포로정의7. 도 2A-2B에서볼 수 있듯이, E2 처리된 세포는 차량 처리셀7에비해 2개 이상의 활성 GREB1 송계를 보이는 세포의 4배 증가 분획을 갖는다.
도 2: 셀별 및 알레일-별 수준에서 E2 유도 GREB1의 양. (A)셀당 활성 GREB1 알레일의 분포는 차량(blue bar) 및 E2(적색 막대) 처리된 세포입니다. (b)전사 활성으로 간주되는 세포의 분수는, 여기에 두 개 이상의 활성 GREB1 을 가진 세포로정의된7. (C)각 치료에 대해 세포당 GREB1 성숙 mRNA의 분포. (D)GREB1 성숙한 RNA/세포의 평균 수는 인구에 대한 평균 값으로 표현된다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
인트론은 초기 mRNA에서 접합되어 엑손 서열만으로 구성된 성숙한 mRNA를 생성합니다. 따라서, 녹색 반점의 수를 정량화함으로써 세포당 성숙한 mRNA의 수를 계산하는 것도 가능하다. 도 2C-2D는 E2 치료 후 세포 집단에서 성숙한 GREB1 mRNA/세포 및 골재 접기 변화(20x)의 분포의 변화를 보여준다.
E2-처리의 24 시간 이상 본래 관측에 맞추어, 모든 세포가 동일한 방식으로 반응하는 것은 아닙니다 (즉, 반응은 MCF-7 인구에서 이질적입니다)7. 예를 들어, 세포당 성숙한 GREB1 mRNAs의 수는 24시간 E2 처리 된 세포에서도 방대한 범위의 발현 (~15 배)을 나타낸다; 벌크 RNA 수량 방법은 통계 평균에 의해 세포내 전사의 광범위한 수준을 분별하지 못합니다. 이것은 동종 세포의 인구에 있는 이질적인 세포 세포 및 유전자 제일-유전자 반응을 탐구하기 위하여 smFISH의 힘을 강조합니다.
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Discussion
설명된 smFISH 방법론은 이전에 게시된 프로토콜7,12,14를기반으로 합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 습식 실험실에서 최적화 된 중요한 단계를 설명 (파종 밀도 포함, 고정 시간, 과구화, 및 프로브 농도), 이미징 및 이미지 분석에, 유전자 전사의 단일 세포 분석을 수행에 관심이 실험실을위한 전체 실험 파이프 라인을 제공.
단일 세포 분석을 용이하게 하기 위해 셀이 하위 conconfluent이며 세포 경계없이 셀 테두리가 추정되도록 겹치지 않는 것이 중요합니다. 실험 기간 동안 세포 밀도를 최적화하기 위해 광범위한 파종 밀도에 걸친 세포 증식 분석서를 완료하는 것이 좋습니다.
성공적인 smFISH 실험에 최적의 고정 시간을 결정하는 것은 매우 중요합니다. 우리는 4 % 정제 포름알데히드로 샘플을 고정, 얼음에 30 분 동안 VRC를 포함하는 멸균 PBS에서 희석, 크게 관심요인에 대한 항체의 조합을 통해 구조적 분석이 필요한 경우, 고품질 smFISH 이미지의 일관성을 향상시킨다. 포름알데히드는 거대 분자를 교차 연결하여 샘플을 수정하고 유기용매(25)를사용하는 것과 같은 다른 고정 방법보다 세포 구조를 더 잘 유지할 수 있다. 그러나 특정시료(26)를과도하게 또는 과소 고정하지 않도록 고정 시간 및 온도를 조정하는 것이 필요하다. VRC는 RNA 분해를 감소시키고 특히 낮은 풍부한RNA(27)에도움이 되기 때문에 유용하다. 우리가 permeabilization 단계에 대한 성공을 거둔 두 가지 옵션이 있습니다. 첫 번째는 4°C에서 70% 에탄올 인큐베이션이고 두 번째는 실온7,14에서0.5% 트리톤-X100 인큐베이션이다. 이미징 호환 유리 바닥 멀티웰 플레이트(96 및 384 웰)를 사용하여 높은 처리량에서 동일한 프로토콜을 수행할 수 있습니다. smFISH 를 수행하는 일관된 성공은 VRC를 포함하는 고정을 사용하여 유리 멀티웰 플레이트를 사용하고, 침투 단계에 대한 VRC와 0.5 % Triton-X 100을 사용하는 데 달려 있습니다. 광학 플라스틱 바닥 판은 옵션이지만 이미지 품질과 성공은 현저히 낮습니다.
단일 셀 분석을 위해 높은 신호 대 잡음 비율이 필요하며 배경 신호와 거짓 긍정을 필터링하고 회절 제한 지점을 올바르게 식별합니다. 배경 신호는 관심 신호의 강도 값을 추가합니다. 높은 배경은 종종 최적 이하의 실험 설계에서 발생하며 형광 강도 측정에서 빼지만, 처음에 가능한28개의배경 신호로 관심 영역을 이미지화하는 것이 가장 좋습니다. 최소 ~10배 차이의 높은 다이나믹 레인지는 신호가관심도(29)의배경 또는 신호로 간주되는지 여부를 성공적으로 결정해야 한다. 거짓 긍정 반점은 셀 경계 외부에 거주하는 신호를 참조하며, 종종 제대로 세척되지 않은 커버립, 혼성화 에 따른 세척 불충분 또는 프로브 자체연결(30)에서발생하는 프로브 집계로 인해 발생합니다. 대상과 다른 RNA로 설정된 올리고의 가짜 결합으로 인한 비특이적 신호가 발생하는 경우(즉, 의사 유전자 또는 서열 유사성으로 인해), 관심 유전자를 발현하지 않는 모델(즉, 녹아웃 MEFs, CRISPR/Cas9녹아웃)에서프로브 세트를 테스트하여 평가할 수 있다. 또한, 어떤 형광 현미경 실험과 마찬가지로, 인트론 및 엑손 프로브는 관상 분리되어야 합니다. 본예 실험에서, 우리는 GREB1 프로브 세트에 대해 Atto 647N 및 Quasar 570 염료를 선택했는데, 이는 현미경에 대한 필터 세트의 사양과 호환되어 있으며, 광표백에 강하고 상대적으로 높은 양자 수율8,14,32를갖는 것이다. 샘플에 따라 각 프로브 세트에 대해 최적의 신호 대 잡음 비율을 식별하기 위해 스톡 프로브(일반적으로 1:200 ~ 1:1000 희석 또는 12.5 nM ~ 62.5 nM)의 희석 계열을 만드는 것이 좋습니다. 일부 공급업체는 사용자 선택형 형광과 맞춤형 프로브를 제공하여 밝기를 높이고, 광표백을 줄이며, 필요한 경우 대부분의 현대 형광 현미경7,8,14에서일반적으로 사용할 수 있는 1-2 채널을 추가합니다. smFISH는 저풍부 RNA를 측정하는 기능이 있더라도, 중요한 문제점은 부분적으로 저하된 RNA를 검출하는 그것의 감도 그리고 기능을 증가하고 있습니다, 특히 조직 견본을 위해. 더 높은 신호 대 잡음 비율을 달성하는 것은 신호를 증폭하도록 설계된 분기 DNA 프로브를 사용하여 가능하다, 우리는이 방법을 발견하지 못했지만33. 공초점 현미경은 집중광원을 사용하여 샘플을 비추는 동시에 하나 이상의 핀홀로 검출기에 도달하는 데 초점을 맞지 않는 빛을 차단합니다. 포인트 스캐닝 공초점 현미경 검사는 일반적으로 RNA-FISH 이미징에 대 한 권장 됩니다 때문에 프로브 레이저 조명에서 더 빨리 표백 광 표백 것 이다. 그러나, 시료 및 신호 강도에 따라, 공초점 현미경은 신호 손실8거의또는 전혀 없는 심상을 생성할 수 있습니다. 여기서, 우리는 FISH프로브(34)에의해 방출되는 광자의 최대 수를 수집하기 위해 높은 배율 및 높은 수치 조리개 목표를 가진 광시야 에피플루오에센션 현미경을 이용했다. z-스택의 인접 한 평면에서 초점이 벗어난 빛에 의해 이미지가 흐려질 수 있지만, 회복 적 디온 볼루션 알고리즘은원산지(34)에획득 된 z 스택 중 의 분산 광을 계산적으로 "재할당"에 적용한다. 이렇게 하면 이미지 분석을 위한 최종 고해상도 이미지가 생성됩니다. 가능하면 다양한 이미징 양식과 경험적으로 비교하여 실험28에가장 적합한 시스템을 결정하는 것이 가장 좋습니다.
smFISH의 많은 가능한 확장 및 응용 프로그램이 있습니다. 모델 실험에서 GREB1 유전자에 대한 한 세트의 프로브로 한 라운드의 혼성화를 완료했습니다. 그러나, 순차적인 방식으로 여러 차례의 스미피쉬를 완료할 수 있다(seqFISH)13,35. 이 방법에서, 셀내의 mRNA는 혼성화, 이미징, 프로브 스트리핑 및 재혼화의 순차적 라운드에 의해 표지된다. 전체 전사 수준까지 멀티플렉싱을 크게 증가시키기 위해 바코딩 기술(예: MER-FISH)36,37,38이개발되었다. 이것은 각 mRNA37,39를고유하게 식별하기 위하여 형광 바코드 전략을 이용합니다. 이러한 기술은 조직에 적응되었으며, 확장 현미경 검사법과 결합될 때, 폴리머 네트워크로 샘플을 물리적으로 확장하는 방법, 내생RNA(36,40,41)에대한 프로브의 증가된 접근을 제공할 수 있다. MER-FISH는 또한 신호 증폭기술(38)에의해 개별 분자의 신호 밝기를 증가시키는 것을 허용한다. 우리가 설명한 프로토콜은 2일 공정이지만, 프로브의 혼성화가 표적 RNA에 혼성화되도록 smFISH 프로토콜을 단축할 수 있어 ~5분(Turbo-FISH)26에서발생할 수 있다. 면역형광은 단일샘플(42)에서단백질과 mRNA를 동시에 검출하기 위해 smFISH(IF-FISH)와 결합될 수 있다. 프로토콜은 샘플에서 단백질 및/또는 RNA 분해의 저하를 줄이기 위해 각 실험에 사용되는 FISH 프로브 및 항체에 최적화되어야 하며, 일부 물질(즉, 완충제 및 고정제)은 단백질과mRNA(43)를모두 처리하는 데 호환되지 않는다. 최적화된 IF-FISH 프로토콜7,18외에도 성공적인 IF-FISH 실험의 예로 당사 연구소의 여러 간행물을 참조하십시오.
결론적으로, 우리는 자극에 반응하여 단일 세포 이질성 및 제일-원자 변화에 대한 통찰력을 제공하는 시투 혼성화(smFISH) 방법에 단일 분자 형광을 제시한다. 이 프로토콜은 이전에 설명된 모델 시스템에 최적화되어 있지만, 우리는 다른 표적 유전자 모델7을향상시킬 수있는 일련의 가능한 조정을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
MAM, FS 및 MGM은 NIEHS (프로젝트 4, P42ES027704, PI, Rusyn)에 의해 투자됩니다. MAM, FS, RMM, MGM 및 PKS는 고급 현미경 및 이미지 정보학을 위한 CPRIT 자금GCC 센터(RP170719)에 의해 지원됩니다. 이미징은 또한 NIH (DK56338, CA125123), CPRIT (RP150578), 댄 L. 던컨 포괄적 인 암 센터, 화학 유전체학을위한 존 S. 던 걸프 해안 컨소시엄의 자금조달과 베일러 의과 대학의 통합 현미경 코어에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
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