एकल अणु मछली द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिव एलील्स का एकल सेल विश्लेषण
Summary
सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल अणु आरएनए फ्लोरेसेंस एकल कोशिका स्तर पर विशिष्ट आरएनए के स्तर और स्थानीयकरण को सही ढंग से निर्धारित करने की एक विधि है। यहां, हम विशिष्ट आरएनए के एकल सेल क्वांटिफिकेशन के लिए गीले बेंच प्रसंस्करण, इमेजिंग और छवि विश्लेषण के लिए हमारे मान्य प्रयोगशाला प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।
Abstract
जीन प्रतिलेखन सेल जीव विज्ञान में एक आवश्यक प्रक्रिया है, और कोशिकाओं की व्याख्या और आंतरिक और बाहरी संकेतों का जवाब करने के लिए अनुमति देता है । पारंपरिक थोक जनसंख्या विधियों (उत्तरी दाग, पीसीआर, और RNAseq) जो mRNA स्तर को मापते हैं, प्रतिक्रियाओं में सेल-टू-सेल भिन्नता के बारे में जानकारी प्रदान करने की क्षमता की कमी है। सटीक एकल कोशिका और एलीलिक विज़ुअलाइज़ेशन और मात्राकरण सीटू संकरण (एसएमफिश) में एकल अणु आरएनए फ्लोरेसेंस के माध्यम से संभव है। आरएनए-फिश लेबल ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के साथ लक्ष्य आरएनए को संकरण करके किया जाता है। इन्हें मध्यम/उच्च थ्रूपुट तौर-तरीकों से चित्रित किया जा सकता है, और छवि विश्लेषण पाइपलाइनों के माध्यम से, परिपक्व और नवजात दोनों आरएनए पर मात्रात्मक आंकड़े प्रदान करते हैं, सभी एकल सेल स्तर पर । निर्धारण, पारमेबिलाइजेशन, संकरण और इमेजिंग कदम कई वर्षों में प्रयोगशाला में मॉडल प्रणाली का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है यहां वर्णित है, जो सफल और मजबूत smfish लेबलिंग के एकल सेल विश्लेषण में परिणाम है । नमूना तैयारी और प्रसंस्करण के साथ मुख्य लक्ष्य झूठी सकारात्मक को कम करने और अधिक सटीक डेटा प्रदान करने के लिए उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात की विशेषता वाली उच्च गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन करना है। यहां, हम विशिष्ट नमूनों के अनुरूप सुझावों और अनुकूलन चरणों के साथ संयोजन के रूप में नमूना तैयारी से डेटा विश्लेषण तक पाइपलाइन का वर्णन करने वाला प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Introduction
जीन ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद जीव विज्ञान की केंद्रीय हठधर्मिता में शामिल दो प्रमुख प्रक्रियाएं हैं, जो डीएनए अनुक्रम से आरएनए से प्रोटीन1तक जा रही हैं । इस अध्ययन में, हम ट्रांसक्रिप्शन के दौरान मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के उत्पादन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। नवजात आरएनए अणु में गैर-कोडिंग इंट्रोन और कोडिंग एक्सोन दोनों शामिल हैं। राइबोसोम्स2,3 पर अनुवाद के लिए एमआरएनए के साइटोप्लाज्म में जाने से पहले इंट्रॉन को सह-ट्रांसक्रिप्शन रूप से बाहर निकालाजाताहै।
परंपरागत रूप से, एमआरएनए का माप कोशिकाओं की थोक आबादी (सैकड़ों से लाखों) में किया जाता है, जिसमें क्लासिक परख जैसे आरटी-क्यूपीसीआर या उत्तरी ब्लॉटिंग होते हैं। जबकि बहुत शक्तिशाली, ये विधियां सीमित हैं क्योंकि वे सेल-टू-सेल भिन्नता (फेनोटाइपिक हेट्रोजेनिटी) में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं, ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय एलील्स की संख्या की पहचान, और शायद अधिक महत्वपूर्ण बात, स्थानिक जानकारी की कमी। हाल ही में, एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (आरएनसीक्यू) के लिए अनुमति देने वाली जीनोम वाइड प्रौद्योगिकियों ने इमेजिंग विधियों और अनुक्रमण4के बीच के अंतर को पाटना शुरू किया। हालांकि, आरएनसीक्यू अपेक्षाकृत कम पहचान क्षमता से ग्रस्त है और प्रसंस्करण चरणों के परिणामस्वरूप स्थानिक जानकारी 5 का पूरा नुकसानहोताहै। हालांकि एकल कोशिका आरएनसीक्यू आइसोजेनिक कोशिकाओं की आबादी के बीच फेनोटाइपिक हेट्रोजेनिटी में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन सीटू संकरण (आरएनए-फिश) में आरएनए फ्लोरेसेंस स्थानिक स्तर पर लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की अधिक पूर्ण खोज की सुविधा प्रदान कर सकता है, और एक एलील-बाय-एलीले आधार6,7पर।
आरएनए फिश एक तकनीक है जो निश्चित कोशिकाओं में लक्षित आरएनए अणुओं का पता लगाने और स्थानीयकरण के लिए अनुमति देती है। पहले के विपरीत, श्रमसाध्य तरीकों, वर्तमान राज्य के अत्याधुनिक आरएनए-मछली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग करता है जो लक्ष्य आरएनए दृश्यों के पूरक हैं, और ये जांच वाटसन-क्रिक बेस द्वारा अपने लक्ष्यों को संकरित करती हैं8। सीटू संकरण तकनीकों की शुरुआत में 1 9 6 9 में गॉल और पारड्यू द्वारा स्थापित एक समान प्रोटोकॉल शामिल था, क्योंकि एक नमूने को न्यूक्लिक एसिड जांच के साथ संसाधित किया गया था जो विशेष रूप से एक लक्ष्य आरएनए9को संकरित करता था। मूल रूप से परख रेडियोधर्मी या कोलोरिमेट्रिक डिटेक्शन का उपयोग करके किया गया था; हालांकि, 1980 के दशक में, डीएनए मछली और बाद में आरएनए मछली के लिए सीटू संकरण (मछली) प्रोटोकॉल में फ्लोरेसेंस के विकास ने अधिक संवेदनशील पता लगाने की दिशा में मार्ग खोला, और मल्टीप्लेक्सिंग10, 11की क्षमता ।
आरएनए फिश में आगे की घटनाओं के कारण एकल आरएनए अणुओं (एसएमफिश)12,13का पता लगाने और उन्हें निर्धारित करने की क्षमता हुई है । डायरेक्ट डिटेक्शन एक ऐसी विधि है जिसमें जांच खुद फ्लोरोफोरस के साथ लेबल की जाती है। smfish के साथ एक चुनौती यह है कि फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने को अलग, विवर्तन-सीमित स्थानों के रूप में सुविधाजनक बनाने के लिए पर्याप्त संकरण जांच/लक्ष्य की आवश्यकता है । इस मुद्दे के समाधान के लिए, कोई भी लक्ष्य आरएनए8,12, 14के विभिन्न क्षेत्रों के पूरक छोटे एकल फंसे डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के जांच सेट का उपयोग कर सकता है। कई जांच के बाध्यकारी स्थानीय फ्लोरोफोर घनत्व बढ़ जाती है, जिससे आरएनए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एक अलग, उच्च तीव्रता वाले स्थान के रूप में दिखाई देता है। यह विधि लाभप्रद है क्योंकि जांच सेट पूल में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के ऑफ-टारगेट बाइंडिंग को सही संकेत और नकली ओलिगोन्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग के बीच अंतर करने के लिए स्पॉट आकार और तीव्रता का मात्रात्मक विश्लेषण करके सही आरएनए स्पॉट सिग्नल से अलग किया जा सकता है, इस प्रकार झूठी सकारात्मक12को कम करके अधिक सटीक विश्लेषण की सुविधा प्रदान की जा सकती है।
MRNA का पता लगाने के लिए वैकल्पिक तरीके क्लासिक बीएसी क्लोन आधारित निक अनुवाद विधि और अधिक हाल ही में विकसित शाखाओं में बंटी डीएनए प्रणाली हैं । बीएसी-क्लोन, निक-अनुवाद विधि में, लेबल किए जाने वाले डीएनए को एंजाइमेटिक रूप से-निक्ड किया जाता है और उजागर 3 ‘ अंत में एक नया न्यूक्लियोटाइड जोड़ा जाता है । डीएनए पॉलीमरेज की गतिविधि मैं एक लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड को जोड़ता है जिसके परिणामस्वरूप वांछित जांच15,16 शाखापंखे डीएनए तकनीक में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच शामिल है जो आरएनए लक्ष्यों के जोड़े में संकरण करती है और ये जांच कई संकेत प्रवर्धन अणुओं का उपयोग करके परिलक्षित होती हैं। यह विधि सिग्नल-टू-शोर अनुपात में काफी सुधार कर सकती है लेकिन प्रवर्धन सटीक मात्रा को तिरछा कर सकता है क्योंकि फ्लोरोसेंट स्पॉट आकार और तीव्रता17में बेतहाशा अलग हो सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में, जो पूरी तरह से NIEHS Superfund अनुसंधान कार्यक्रम की भागीदारी के भाग के रूप में कार्यरत है Galveston खाड़ी में एंडोक्राइन बाधित रसायनों के प्रभाव की मात्रा/ E2 कई ईआर-टारगेट जीन को नियंत्रित करता है, जिसमें प्रोटोटाइप ईआर-टारगेट जीन, GREB17,20,21, 22शामिल हैं। यहां वर्णित एसएमफिश प्रोटोकॉल GREB1 को लक्षित करने वाले दो स्पेक्ट्रली-अलग जांच सेटों के एक सेट का उपयोग करता है; एक जो एक्सॉन करने के लिए संकरित करता है और दूसरा इंट्रोन के लिए, परिपक्व और नवजात आरएनए 7 दोनों के माप के लिए अनुमतिदेताहै । फिर हम प्रति सेल सक्रिय एलील्स और परिपक्व आरएनए की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि विश्लेषण दिनचर्या लागू करने के लिए छवि एसएमफिश लेबल नमूनों के लिए deconvolution के साथ मिलकर epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित स्मफिश पद्धति पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल 7,12,14पर आधारित है। इस प्रोटोकॉल में, हम गीले प्रयोगशाला (सीडिंग घनत्व, निर्धारण समय, पारमेबिलाइजेशन और जांच एकाग्रता ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमएएम, एफएस और एमजीएम को एनआईईएचएस (प्रोजेक्ट 4, पी42ईएस027704, पीआई, रुसिन) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। एमएएम, एफएस, आरएमएम, एमजीएम और पीकेएस को सीपीआरएटी-वित्त पोषित जीसीसी सेंटर फॉर एडवांस्ड माइक्रोस्कोपी एंड इमेज इन्फॉर्मेटिक्स (RP170719) द्वारा समर्थित किया जाता है। इमेजिंग भी NIH (DK56338, और CA125123), CPRIT (RP150578), दान एल डंकर व्यापक कैंसर केंद्र, और रासायनिक जीनोमिक्स के लिए जॉन एस डन खाड़ी तट कंसोर्टियम से धन के साथ बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन में एकीकृत माइक्रोस्कोपी कोर द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
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