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Biochemistry

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Published: September 20, 2020
doi:
10.3791/61680
, , , ,
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology,Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology,Baylor College of Medicine

Summary

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única (smFISH) es un método para cuantificar con precisión los niveles y la localización de ARN específicos a nivel de una sola célula. Aquí, informamos nuestros protocolos de laboratorio validados para el procesamiento de bancos húmedos, imágenes y análisis de imágenes para la cuantificación de células individuales de ARN específicos.

Abstract

La transcripción de genes es un proceso esencial en biología celular, y permite a las células interpretar y responder a señales internas y externas. Los métodos tradicionales de población a granel (Northern blot, PCR y RNAseq) que miden los niveles de ARNm carecen de la capacidad de proporcionar información sobre la variación de célula a célula en las respuestas. La visualización y cuantificación precisa de una sola célula y alélica es posible a través de la hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única (smFISH). El ARN-FISH se realiza mediante la hibridación de ARN diana con sondas de oligonucleótidos etiquetadas. Estos se pueden obtener imágenes en modalidades de rendimiento medio / alto y, a través de canalizaciones de análisis de imágenes, proporcionan datos cuantitativos sobre ARN maduros y nacientes, todo a nivel de una sola celda. Los pasos de fijación, permeabilización, hibridación e imagen se han optimizado en el laboratorio durante muchos años utilizando el sistema modelo descrito en este documento, lo que resulta en un análisis exitoso y robusto de una sola célula del etiquetado smFISH. El objetivo principal con la preparación y el procesamiento de muestras es producir imágenes de alta calidad caracterizadas por una alta relación señal-ruido para reducir los falsos positivos y proporcionar datos que sean más precisos. Aquí, presentamos un protocolo que describe la canalización desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos junto con sugerencias y pasos de optimización para adaptarse a muestras específicas.

Introduction

La transcripción y traducción de genes son los dos principales procesos implicados en el dogma central de la biología, pasando de la secuencia de ADN al ARN y a la proteína1. En este estudio, nos centramos en la producción de ARN mensajero (ARNm) durante la transcripción. La molécula de ARN naciente incluye tanto intrones no codificantes como exones codificantes. Los intrones se empalman co-transcripcionalmente antes de que el ARNm se mueva hacia el citoplasma para su traducción en los ribosomas2,3.

Tradicionalmente, la medición de ARNm se realiza en poblaciones masivas de células (cientos a millones) con ensayos clásicos como RT-qPCR o Northern blotting. Si bien son muy poderosos, estos métodos son limitados, ya que no proporcionan información sobre la variación de célula a célula (heterogeneidad fenotípica), la identificación del número de alelos transcripcionalmente activos y, quizás lo más importante, carecen de información espacial. Más recientemente, las tecnologías de todo el genoma que permiten la secuenciación de ARN de una sola célula (RNAseq) comenzaron a cerrar la brecha entre los métodos de imagen y la secuenciación4. Sin embargo, RNAseq sufre de eficiencias de detección relativamente bajas y los pasos de procesamiento resultan en una pérdida completa de información espacial5. Aunque RNAseq de una sola célula puede proporcionar información sobre la heterogeneidad fenotípica entre una población de células isogénicas, la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (RNA-FISH) puede facilitar una exploración más completa de la expresión génica objetivo a nivel espacial, y sobre una base de alelo por alelo6,7.

RNA FISH es una técnica que permite la detección y localización de moléculas de ARN diana en células fijas. A diferencia de los métodos anteriores y laboriosos, el RNA-FISH actual de última generación utiliza sondas de ácido nucleico disponibles comercialmente que son complementarias a las secuencias de ARN objetivo, y estas sondas se hibridan a sus objetivos mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick8. Las primeras técnicas de hibridación in situ implicaron un protocolo similar establecido por Gall y Pardue en 1969, ya que una muestra se procesó con sondas de ácido nucleico que se hibridaron específicamente a un ARN objetivo9. Originalmente el ensayo se realizaba mediante detección radiactiva o colorimétrica; sin embargo, en la década de 1980, el desarrollo de protocolos de hibridación fluorescente in situ (FISH) para ADN FISH y más tarde ARN FISH abrió la ruta hacia una detección más sensible, y el potencial de multiplexación10,11.

Otros desarrollos en RNA FISH han llevado a la capacidad de detectar y cuantificar moléculas individuales de ARN (smFISH)12,13. La detección directa es un método en el que las sondas mismas se etiquetan con fluoróforos. Un desafío con smFISH es que existe la necesidad de suficientes sondas de hibridación / objetivo para facilitar la detección de señales fluorescentes como puntos distintos y limitados por difracción. Para abordar este problema, se puede utilizar un conjunto de sondas de oligonucleótidos cortos de ADN monocatenario complementarios a varias regiones del ARN objetivo8,12,14. La unión de múltiples sondas aumenta la densidad del fluoróforo local, haciendo que el ARN sea visible como un punto distinto de alta intensidad mediante microscopía de fluorescencia. Este método es ventajoso porque la unión fuera del objetivo de los oligonucleótidos en el conjunto de sondas puede distinguirse de la verdadera señal puntual de ARN mediante el análisis cuantitativo del tamaño y la intensidad del punto para diferenciar entre la señal verdadera y la unión espuria a oligonucleótidos, facilitando así un análisis más preciso al reducir los falsos positivos12.

Los métodos alternativos para detectar arNm son el método clásico de traducción de nick basado en clones de BAC y el sistema de ADN ramificado desarrollado más recientemente. En el método de traducción de nick clonado por BAC, el ADN a etiquetar se corta enzimáticamente y se agrega un nuevo nucleótido al extremo 3′ expuesto. La actividad de la ADN polimerasa I añade un nucleótido etiquetado dando como resultado la sonda deseada15,16. La técnica de ADN ramificado involucra sondas de oligonucleótidos que se hibridan en pares con objetivos de ARN y estas sondas se amplifican utilizando múltiples moléculas de amplificación de señal. Este método puede mejorar significativamente la relación señal-ruido, pero la amplificación puede sesgar la cuantificación precisa ya que los puntos fluorescentes pueden ser muy diferentes en tamaño e intensidad17.

Como sistema modelo para este protocolo, que se emplea completamente como parte de la participación del Programa de Investigación Superfund de NIEHS para cuantificar los efectos de los productos químicos disruptores endocrinos en Galveston Bay / Houston Ship Channel, utilizamos la línea celular de cáncer de mama MCF-7 con receptor de estrógeno (ER) positivo tratada durante la noche con un agonista de ER, 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 regula muchos genes diana ER, incluyendo el gen prototípico ER-diana, GREB17,20,21,22. El protocolo smFISH descrito aquí utiliza un conjunto de dos conjuntos de sondas separados espectralmente dirigidos a GREB1; uno que se hibrida a exones y el otro a intrones, permitiendo la medición de ARN7maduro y naciente. Luego utilizamos microscopía de epifluorescencia junto con la deconvolución para obtener imágenes de muestras etiquetadas con smFISH, y luego aplicamos rutinas de análisis de imágenes para cuantificar el número de alelos activos y ARN maduros por célula.

Protocol

Para garantizar resultados óptimos, la parte de laboratorio húmedo de este protocolo requiere precauciones estándar sin RNasa en todos los pasos. Por ejemplo, se recomienda encarecidamente el uso de puntas de pipeta filtradas, vasos estériles y tampones libres de RNasa. También se sugiere el uso de inhibidores de la RNasa como los complejos de ribonucleósidos de vanacil, especialmente para los ARN diana de baja abundancia. 1. Cultivo celular y configuración experimental</…

Representative Results

Para analizar las respuestas hormonales a través de smFISH, como ejemplo, elegimos el modelo de receptor de estrógeno (ER) utilizado en ensayos de alto rendimiento para determinar la presencia de sustancias químicas disruptoras endocrinas en desastres ambientales en el contexto de la participación en el Programa de Investigación superfondo del NIEHS7. En este experimento, las células adherentes de cáncer de mama MCF-7 fueron tratadas con el agonista ER 17β-estradiol (E2, 10 nM) o vehículo…

Discussion

La metodología smFISH descrita se basa en protocolos previamente publicados7,12,14. En este protocolo, explicamos los pasos críticos que se optimizaron desde el laboratorio húmedo (incluida la densidad de siembra, el tiempo de fijación, la permeabilización y la concentración de la sonda), hasta las imágenes y el análisis de imágenes, proporcionando una tubería experimental completa para los laboratorios interesados en …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MAM, FS y MGM están financiados por NIEHS (Proyecto 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM y PKS cuentan con el apoyo del Centro GCC de Microscopía Avanzada e Informática de Imágenes (RP170719), financiado por el CPRIT. Las imágenes también cuentan con el apoyo del Núcleo de Microscopía Integrada en Baylor College of Medicine con fondos de NIH (DK56338 y CA125123), CPRIT (RP150578), el Centro Oncológico Integral Dan L. Duncan y el Consorcio John S. Dunn de la Costa del Golfo para Genómica Química.

Materials

17β Estradiol Sigma-Aldrich E2257 CAS Number 50-28-2
Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free ThermoFisher Scientific AM9770
Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose Fisher Scientific MT10017CV Manufactured by Invitrogen
DAPI Sigma-Aldrich D8417 Without sodium pyruvate
Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile Sigma-Aldrich 3730-100ML
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ Corning 21030CV Manufactured by Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%) Fisher Scientific 07-678-005
Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate Corning 353047 Manufactured by Decon Laboratories
Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL Fisher Scientific 50-753-2978 Manufactured by Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope GE Healthcare
Hyclone Water, Molecular Biology Grade Fisher Scientific SH3053802
Immersion Oil 1.516 GE Healthcare Life Sciences 29162940 Manufactured by GE Healthcare Bio-Science
L-glutamine Solution Fisher Scientific MT25005Cl Manufactured by Corning
MCF-7 cells ATCC HTB-22
Molecular Grade Formamide Promega PAH5051
Olympus 60x/1.42 NA Objective Olympus
Parafilm Bemis Company, Inc. 52858-076 Distributed by VWR
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicilin-Streptomycin Solution Fisher Scientific MT3001Cl Manufactured by Corning
Ribonucleoside Vanadyl Complex VWR 101229-716 Manufactured by New England Biosciences
RNase Away Ambion 9780
Sodium pyruvate, 100 mM Fisher Scientific 11-360-070 Manufactured by Gibco
Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 Fisher Scientific 12-545-81P
Triton X-100, 100 mL Fisher Scientific BP151-100 Manufactured by Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Solution 0.25% Sigma-Aldrich T4049-500ML
Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL Fisher Scientific NC9265087 Manufactured by Vector Laboratories
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References

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