Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH
Summary
Single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een methode om niveaus en lokalisatie van specifieke RNA’s op het niveau van één cel nauwkeurig te kwantificeren. Hier rapporteren we onze gevalideerde laboratoriumprotocollen voor natte-bench verwerking, beeldvorming en beeldanalyse voor eencellige kwantificering van specifieke RNA’s.
Abstract
Gentranscriptie is een essentieel proces in de celbiologie en stelt cellen in staat om interne en externe signalen te interpreteren en erop te reageren. Traditionele bulkpopulatiemethoden (Northern blot, PCR en RNAseq) die mRNA-niveaus meten, missen het vermogen om informatie te verstrekken over cel-naar-celvariatie in reacties. Nauwkeurige single cell en allelische visualisatie en kwantificering is mogelijk via single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH). RNA-FISH wordt uitgevoerd door doel-RNA’s te hybridiseren met gelabelde oligonucleotidesondes. Deze kunnen worden afgebeeld in modaliteiten met een gemiddelde / hoge doorvoer en bieden, via beeldanalysepijplijnen, kwantitatieve gegevens over zowel volwassen als ontluikende RNA’s, allemaal op het niveau van één cel. De fixatie-, permeabilisatie-, hybridisatie- en beeldvormingsstappen zijn gedurende vele jaren in het laboratorium geoptimaliseerd met behulp van het hierin beschreven modelsysteem, wat resulteert in een succesvolle en robuuste eencellige analyse van smFISH-etikettering. Het belangrijkste doel met monstervoorbereiding en -verwerking is om beelden van hoge kwaliteit te produceren die worden gekenmerkt door een hoge signaal-ruisverhouding om valse positieven te verminderen en gegevens te leveren die nauwkeuriger zijn. Hier presenteren we een protocol dat de pijplijn beschrijft van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse in combinatie met suggesties en optimalisatiestappen om aan te passen aan specifieke monsters.
Introduction
Gentranscriptie en translatie zijn de twee belangrijkste processen die betrokken zijn bij het centrale dogma van de biologie, gaande van de DNA-sequentie tot RNA tot eiwit1. In deze studie richten we ons op de productie van boodschapper-RNA (mRNA) tijdens transcriptie. Het ontluikende RNA-molecuul omvat zowel niet-coderende introns als coderende exonen. Introns worden co-transcriptioneel uitgesplitst voordat het mRNA in het cytoplasma gaat voor translatie op de ribosomen2,3.
Traditioneel wordt de meting van mRNA uitgevoerd in bulkpopulaties van cellen (honderden tot miljoenen) met klassieke assays zoals RT-qPCR of Northern blotting. Hoewel zeer krachtig, zijn deze methoden beperkt omdat ze geen inzicht geven in cel-tot-celvariatie (fenotypische heterogeniteit), identificatie van het aantal transcriptioneel actieve allelen en, misschien nog belangrijker, gebrek aan ruimtelijke informatie. Meer recent begonnen genoombrede technologieën die RNA-sequencing met één cel (RNAseq) mogelijk maakten, de kloof tussen beeldvormingsmethoden en sequencing te overbruggen4. RNAseq heeft echter last van relatief lage detectie-efficiënties en de verwerkingsstappen resulteren in volledig verlies van ruimtelijke informatie5. Hoewel eencellige RNAseq inzicht kan geven in fenotypische heterogeniteit onder een populatie van isogene cellen, kan RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) een completere verkenning van doelgenexpressie op ruimtelijk niveau en op een allel-per-allel basis6,7.
RNA FISH is een techniek die de detectie en lokalisatie van doel-RNA-moleculen in vaste cellen mogelijk maakt. In tegenstelling tot eerdere, bewerkelijke methoden, maakt de huidige state-of-the-art RNA-FISH gebruik van commercieel beschikbare nucleïnezuursondes die complementair zijn aan de doel-RNA-sequenties, en deze sondes hybridiseren naar hun doelen door Watson-Crick base pairing8. De vroege in situ hybridisatietechnieken betroffen een soortgelijk protocol dat in 1969 door Gall en Pardue werd vastgesteld, omdat een monster werd verwerkt met nucleïnezuursondes die specifiek hybridiseerden tot een doel-RNA9. Oorspronkelijk werd de test uitgevoerd met behulp van radioactieve of colorimetrische detectie; echter, in de jaren 1980, de ontwikkeling van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) protocollen voor DNA FISH en later RNA FISH opende de weg naar meer gevoelige detectie, en het potentieel voor multiplexing10,11.
Verdere ontwikkelingen in RNA FISH hebben geleid tot het vermogen om enkele RNA-moleculen (smFISH) te detecteren en te kwantificeren12,13. Directe detectie is een methode waarbij de sondes zelf worden gelabeld met fluoroforen. Een uitdaging met smFISH is dat er behoefte is aan voldoende hybridiserende sondes /target om de detectie van fluorescerende signalen als afzonderlijke, diffractie-beperkte plekken te vergemakkelijken. Om dit probleem aan te pakken, kan men een sondeset van korte enkelstrengs DNA-oligonucleotiden gebruiken die complementair zijn aan verschillende regio’s van hetdoel-RNA 8,12,14. De binding van meerdere sondes verhoogt de lokale fluorofoordichtheid, waardoor het RNA zichtbaar wordt als een afzonderlijke, hoge intensiteitsvlek door fluorescentiemicroscopie. Deze methode is voordelig omdat off-target binding van oligonucleotiden in de probe set pool kan worden onderscheiden van het echte RNA-spotsignaal door kwantitatief de spotgrootte en -intensiteit te analyseren om onderscheid te maken tussen echt signaal en valse oligonucleotidebinding, waardoor een nauwkeurigere analyse wordt vergemakkelijkt door valse positieven te verminderen12.
Alternatieve methoden om mRNA te detecteren zijn de klassieke BAC-kloon-gebaseerde nick-translatiemethode en het meer recent ontwikkelde vertakte DNA-systeem. In de BAC-gekloonde, nick-translatiemethode wordt het te labelen DNA enzymatisch geknepen en wordt een nieuw nucleotide toegevoegd aan het blootgestelde 3′-uiteinde. De activiteit van DNA-polymerase I voegt een gelabeld nucleotide toe, wat resulteert in de gewenste sonde15,16. De vertakte DNA-techniek omvat oligonucleotide-sondes die in paren hybridiseren naar RNA-doelen en deze sondes worden versterkt met behulp van meerdere signaalversterkingsmoleculen. Deze methode kan de signaal-ruisverhouding aanzienlijk verbeteren, maar de versterking kan de nauwkeurige kwantificering scheeftrekken, omdat fluorescerende vlekken enorm kunnen verschillen in grootte en intensiteit17.
Als een modelsysteem voor dit protocol, dat volledig wordt gebruikt als onderdeel van de niehs Superfund Research Program-deelname om de effecten van hormoonontregelende chemicaliën in Galveston Bay / Houston Ship Channel te kwantificeren, gebruikten we de oestrogeenreceptor (ER) positieve borstkankercellijn MCF-7 die ‘s nachts werd behandeld met een ER-agonist, 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 reguleert veel ER-doelgenen, waaronder het prototypische ER-doelgen, GREB17,20,21,22. Het hier beschreven smFISH-protocol maakt gebruik van een set van twee spectraal gescheiden sondesets gericht op GREB1; een die hybridiseert naar exonen en de andere naar introns, waardoor zowel volwassen als ontluikend RNA kan wordengemeten 7. Vervolgens gebruiken we epifluorescentiemicroscopie in combinatie met deconvolutie om smFISH-gelabelde monsters in beeld te brengen en passen we vervolgens beeldanalyseroutines toe om het aantal actieve allelen en volwassen RNA’s per cel te kwantificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven smFISH-methodologie is gebaseerd op eerder gepubliceerde protocollen7,12,14. In dit protocol leggen we de kritieke stappen uit die zijn geoptimaliseerd van het natte laboratorium (inclusief zaaidichtheid, fixatietijd, permeabilisatie en sondeconcentratie), tot beeldvorming en beeldanalyse, waardoor een volledige experimentele pijplijn wordt geboden voor laboratoria die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van eenc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MAM, FS en MGM worden gefinancierd door NIEHS (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM en PKS worden ondersteund door het door CPRIT gefinancierde GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719). Beeldvorming wordt ook ondersteund door de Integrated Microscopy Core aan het Baylor College of Medicine met financiering van NIH (DK56338 en CA125123), CPRIT (RP150578), het Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center en het John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
References
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
- Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
- Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
- Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
- Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
- Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
- Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
- Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
- Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
- Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
- Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
- Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
- Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
- Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
- Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
- Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
- Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).
