Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK
Summary
Enmolekyl RNA fluorescens in situ hybridisering (smFISH) är en metod för att exakt kvantifiera nivåer och lokalisering av specifika RNAs på encellsnivå. Här rapporterar vi våra validerade labbprotokoll för våtbänksbehandling, bildbehandling och bildanalys för encells kvantifiering av specifika RNAs.
Abstract
Genutskrift är en viktig process inom cellbiologi och gör det möjligt för celler att tolka och svara på interna och externa signaler. Traditionella bulkpopulationsmetoder (Northern blot, PCR och RNAseq) som mäter mRNA-nivåer saknar förmågan att ge information om cell-till-cell-variation i svar. Exakt encellig och allelic visualisering och kvantifiering är möjlig via enmolekyl RNA fluorescens in situ hybridisering (smFISH). RNA-FISH utförs genom att hybridisera mål-RNAs med märkta oligonukleotidsonder. Dessa kan avbildas i medelhöga/höga data flödes metoder och, genom avbildnings analys pipelines, tillhandahålla kvantitativa data om både mogna och gryende RNAs, allt på en cell nivå. Fixerings-, permeabiliserings-, hybridiserings- och bildbehandlingsstegen har optimerats i labbet under många år med hjälp av det modellsystem som beskrivs häri, vilket resulterar i framgångsrik och robust encellsanalys av SMFISH-märkning. Huvudsyftet med provberedning och bearbetning är att producera högkvalitativa bilder som kännetecknas av ett högt signal-till-brusförhållande för att minska falska positiva och tillhandahålla data som är mer exakta. Här presenterar vi ett protokoll som beskriver pipelinen från prov förberedelse till data analys i samband med förslag och optimerings steg för att skräddarsy till specifika prover.
Introduction
Genutskrift och översättning är de två viktigaste processerna som är involverade i biologins centrala dogm, som går från DNA-sekvensen till RNA till protein1. I denna studie fokuserar vi på produktion av budbärar-RNA (mRNA) under transkription. Den gryende RNA-molekylen innehåller både icke-kodande introner och kodningsexoner. Introner är co-transcriptionally skarvas ut innan mRNA flyttar in i cytoplasman för översättning på ribosomerna2,3.
Traditionellt utförs mätningen av mRNA i bulkpopulationer av celler (hundratals till miljoner) med klassiska analyser som RT-qPCR eller Northern blotting. Även om dessa metoder är mycket kraftfulla, är de begränsade eftersom de inte ger insikter om cell-till-cell variation (fenotypisk heterogenitet), identifiering av antalet transkriptionellt aktiva alleler och, kanske ännu viktigare, saknar rumslig information. På senare tid har genomomfattande tekniker som möjliggör RNA-sekvensering med en cell (RNAseq) börjat överbrygga klyftan mellan bildframställningsmetoder och sekvensering4. RNAseq lider dock av relativt låg detektionseffektivitet och bearbetningsstegen resulterar i fullständig förlust av rumslig information5. Även om encellig RNAseq kan ge insikter om fenotypisk heterogenitet bland en population av isogena celler, kan RNA fluorescens in situ hybridisering (RNA-FISH) underlätta en mer fullständig utforskning av målgenuttryck på rumslig nivå och på allel-för-allel-basis6,7.
RNA FISH är en teknik som möjliggör detektion och lokalisering av mål RNA-molekyler i fasta celler. Till skillnad från tidigare, mödosamma metoder använder nuvarande toppmoderna RNA-FISH kommersiellt tillgängliga nukleinsyrasonder som kompletterar mål RNA-sekvenserna, och dessa sonder hybridiserar till sina mål av Watson-Crick basparning8. Tidig sort in situ hybridizationtekniker involverade ett liknande protokoll som upprättades av Gall och Pardue i 1969, som ett prov bearbetades med nucleic syra sonder som specifikt hybridiserades till ett mål RNA9. Ursprungligen utfördes analysen med radioaktiv eller kolorimetrisk detektion; Emellertid, i 80-tal, utvecklingen av fluorescens in situ hybridization (FISH) protokoll till DNA-fisk och mer sistnämnd RNA FISK öppnade rutten in mot känsligare upptäckt, och potentiellt för multiplexing10,11.
Ytterligare utveckling i RNA FISH har lett till förmågan att upptäcka och kvantifiera enstaka RNA-molekyler (smFISH)12,13. Direkt detektion är en metod där sonderna själva är märkta med fluorforer. En utmaning med smFISH är att det finns ett behov av tillräckligt med hybridiseringssonder/mål för att underlätta detektion av fluorescerande signaler som distinkta, diffraktionsbegränsade fläckar. För att ta itu med detta problem kan man använda en sonduppsättning korta enkelsträngade DNA-oligonukleotider som kompletterar olika regioner i målet RNA8,12,14. Bindningen av flera sonder ökar den lokala fluorfortätheten, vilket gör RNA synligt som en distinkt, högintensiv fläck genom fluorescensmikroskopi. Denna metod är fördelaktig eftersom off-target bindning av oligonukleotider i sonden set pool kan särskiljas från den sanna RNA spot signalen genom kvantitativt analysera spot storlek och intensitet för att skilja mellan sann signal och falska oligonukleotid bindande, vilket underlättar mer exakt analys genom att minska falska positiva12.
Alternativa metoder för att upptäcka mRNA är den klassiska BAC-klonbaserade nicköversättningsmetoden och det mer nyligen utvecklade förgrenade DNA-systemet. I den BAC-klonade, nick-translation metoden är det DNA som ska märkas enzymatiskt-nickat och en ny nukleotid läggs till den exponerade 3′ änden. Aktiviteten hos DNA-polymeras I lägger till en märkt nukleotid som resulterar i önskad sond15,16. Den grenade DNA-tekniken involverar oligonukleotidsonder som hybridiseras i par till RNA-mål och dessa sonder förstärks med hjälp av flera signalförstärkningsmolekyler. Denna metod kan avsevärt förbättra signal-till-brusförhållandet men förstärkningen kan skeva korrekt kvantifiering eftersom fluorescerande fläckar kan vara mycket olika i storlek och intensitet17.
Som ett modellsystem för detta protokoll, som är fullt använt som en del av NIEHS Superfund Research Program deltagande för att kvantifiera effekterna av hormonstörande kemikalier i Galveston Bay / Houston Ship Channel, använde vi östrogenreceptorn (ER) positiv bröstcancer cellinje MCF-7 behandlas över natten med en ER agonist, 17β-estradiol (E2)7,18,19. E2 reglerar många ER-målgener, inklusive den prototypiska ER-målgenen, GREB17,20,21,22. SmFISH-protokollet som beskrivs här använder en uppsättning av två spektroskt åtskilda sonduppsättningar som är inriktade på GREB1; en som hybridiserar till exons och den andra till introner, vilket möjliggör mätning av både mogna och gryende RNA7. Vi använder sedan epifluorescensmikroskopi i kombination med dekonvolution för att avbilda smFISH-märkta prover och tillämpar sedan bildanalysrutiner för att kvantifiera antalet aktiva alleler och mogna RNAs per cell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna SMFISH-metoden bygger på tidigare publicerade protokoll7,12,14. I det här protokollet förklarar vi de kritiska stegen som optimerades från våtlabbet (inklusive såddtäthet, fixeringstid, permeabilisering och sondkoncentration), till bild- och bildanalys, vilket ger en fullständig experimentell pipeline för laboratorier som är intresserade av att utföra encellsanalys av genutskrift.
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MAM, FS och MGM finansieras av NIEHS (Projekt 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM och PKS stöds av CPRIT-finansierade GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719). Imaging stöds också av Integrated Microscopy Core vid Baylor College of Medicine med finansiering från NIH (DK56338 och CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center och John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics.
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
References
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
- Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
- Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
- Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
- Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
- Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
- Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
- Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
- Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
- Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
- Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
- Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
- Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
- Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
- Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
- Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
- Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).
