抗原タグ付きブロッキング病変とのレプリソーム遭遇の可視化
Summary
DNA付加体との複製フォーク衝突は二本鎖切断を誘発する可能性がありますが、レプリソームとブロッキング病変の間の相互作用についてはあまり知られていません。近接ライゲーションアッセイを使用して、これらの遭遇を視覚化し、レプリソーム組成の結果を特徴付けました。
Abstract
ヌクレアーゼ、放射線、およびその他のDNAブレーカーによって誘発される二本鎖切断(DSB)に対する細胞応答については、かなりの洞察が存在します。部分的には、これは、ブレークサイトを特定するための方法の利用可能性、およびそれらのシーケンスでDSBに採用された要因の特性評価を反映しています。ただし、DSBは、切断を直接引き起こさず、特定の配列部位で反応しない化合物によって形成されるDNA付加体の処理中に中間体としても現れます。したがって、これらの薬剤のほとんどについて、応答因子および修復タンパク質との結合相互作用の解析を可能にする技術は不明である。たとえば、DNA鎖間架橋(ICL)は、複製フォークに遭遇した後に切断を引き起こす可能性があります。がん化学療法薬として広く使用されている薬剤によって形成されていますが、複製タンパク質との相互作用をモニタリングするための方法論はありませんでした。
ここでは、これらの困難な付加体とのフォーク衝突に対する細胞応答を追跡するための戦略について説明します。我々は、ステロイド抗原を、生細胞の核内で光活性化依存性ICLを形成するソラレンに結合させた。ICLは、抗原タグに対する免疫蛍光によって視覚化されました。タグは、2つの抗原の密接な関連を報告する近接ライゲーションアッセイ(PLA)のパートナーにすることもできます。PLAは、タグ付けされたICLと密接に関連しているタンパク質とそうでないタンパク質を区別するために利用されました。ICLとの遭遇後に保持されたレプリソームタンパク質を定義し、失われた他のタンパク質を特定することができました。このアプローチは、免疫学的に検出できるあらゆる構造またはDNA付加体に適用できます。
Introduction
二本鎖切断に対する細胞応答は、切断を特定のゲノム部位に向けるための一連のますます強力な方法のために十分に文書化されています1,2,3。位置の確実性により、部位に蓄積してDNA損傷応答(DDR)に関与するタンパク質やその他の要因の明確な特性評価が可能になり、それによって切断を修復する非相同末端結合(NHEJ)および相同組換え(HR)経路が促進されます。もちろん、特定の配列を攻撃しない放射線や化学種などの薬剤によって多くのブレークが導入されます4。ただし、これらのために、端をタグ付けとローカリゼーションに適した構造に変換できる手順があります5,6。ブレークは、免疫グロブリンの再配列などの生物学的プロセスによっても導入され、最近の技術では、それらの局在化も可能になっています7。次に、応答因子とそれらのサイトとの関係を決定できます。
ブレークは、固有のブレーカーではないが転写や複製などのDNAトランザクションを妨害する化合物によって形成される付加物の間接的な結果としても現れます。それらは、おそらく修復中に、またはヌクレアーゼ攻撃に対して脆弱な構造を誘発するために、これらの障害物に対する細胞応答の特徴として形成され得る。通常、付加体、ブレーク、および応答因子との関連の間の物理的関係は推論的です。例えば、ICLは、シスプラチンおよびマイトマイシンC8などの化学療法剤によって、および非塩基性部位9の反応生成物として形成される。ICLは、複製フォーク10に対する強力なブロックとしてよく知られており、それによってヌクレアーゼ11によって切断され得るフォークを失速させる。鎖間の共有結合は、中間体12,13として絶対的な切断を有する経路によってしばしば緩和され、複製フォーク14を再構築するために相同組換えを必要とする。ほとんどの実験では、研究者は、レプリケーションフォークとICLの衝突の下流に形成されるブレークに対する関心のある要因の応答を追跡します。しかし、誘発性病変の局在化のための技術がなかったため、リプリソームとその構成部分がICLに近接していることしか想定できません。
私たちは、ICLによってここに示されているように、非配列特異的共有付加体とのタンパク質関連の分析を可能にする戦略を開発しました。私たちのシステムでは、これらは皮膚疾患の治療薬として何千年もの間使用されている光活性天然物であるソラレンによって導入されます15。私たちのアプローチは、ソラレンの2つの重要な特徴に基づいています。1つ目は、シスプラチンやマイトマイシンC 8,16などの一般的な化合物によって形成される10%未満とは対照的に、付加物の90%を超える可能性のある架橋形成の頻度が高いことです。2つ目は、架橋能力を失うことなく、化合物のコンジュゲート化へのアクセシビリティです。私たちは、トリメチルソラレンを、古くから確立された免疫タグであるジゴキシゲニン(Dig)と共有結合させました。これにより、Digタグの免疫染色によるゲノムDNA中のソラレン付加体の検出、および従来の免疫蛍光法による可視化が可能になります17。
この試薬は、以前の研究で、DNAファイバーベースのアッセイ16を使用して、ICLとの複製フォークの遭遇の分析に適用されました。その作業では、レプリケーションが無傷のICLを過ぎても継続できることがわかりました。これは、複製ストレスによって活性化されるATRキナーゼに依存していた。複製の再開は、CMG複製ヘリカーゼの構造を考えると予想外でした。これは、GINS複合体(G、PSF1、2、3、およびSLD5からなる)およびCDC45(C)18のタンパク質によってロックされた、リーディングストランド合成のためのテンプレート鎖の周りにオフセットギャップリングを形成するMCMヘテロ六量体(M)で構成されています。複製がリプリソーム衝突の側のICL遠位側で再開できるという提案は、レプリソームの構造の変更を主張した。ICLとの遭遇時にどのコンポーネントが応答に含まれていたかという問題に対処するために、ここで説明するアプローチを開発しました。近接ライゲーションアッセイ(PLA)19 のパートナーとしてDigタグを利用して、ICLとレプリソーム20のタンパク質との密接な関連を調べました。
Protocol
Representative Results
Discussion
人民解放軍は非常に強力な技術ですが、明確で再現性のある結果を得るために解決しなければならない技術的な懸念があります。抗体は高い親和性と特異性でなければなりません。さらに、非特異的なバックグラウンド信号をできるだけ減らすことが重要です。膜や細胞の破片が背景に寄与していることを発見し、可能な限り除去しました。固定前のバッファーを含む洗剤による洗浄、およ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、米国国立老化研究所のNIHの壁内研究プログラム(Z01-AG000746–08)によってサポートされました。J.H.は、中国国家自然科学財団(21708007および31871365)の支援を受けています。
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
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