Antijen Etiketli Blokaj Lezyonu ile Tekrarlayan Karşılaşmaların Görselleştirilmesi
Summary
DNA adduktları ile replikasyon çatalı çarpışmaları çift iplikçik kopmalarına neden olabilirken, replikomlar ve bloke edici lezyonlar arasındaki etkileşim hakkında daha az şey bilinmektedir. Bu karşılaşmaları görselleştirmek ve replisome kompozisyonunun sonuçlarını karakterize etmek için yakınlık ligasyon testini kullandık.
Abstract
Nükleazlar, radyasyon ve diğer DNA kırıcılar tarafından indüklenen çift iplikçik kırılmalarına (DSB’ler) hücresel yanıt hakkında önemli bilgiler mevcuttur. Bu kısmen, kırılma yerlerinin tanımlanması için yöntemlerin kullanılabilirliğini ve bu dizilerde DSB’lere alınan faktörlerin karakterizasyonunu yansıtır. Bununla birlikte, DSB’ler, doğrudan kırılmalara neden olmayan ve belirli sekans bölgelerinde reaksiyona girmeyen bileşikler tarafından oluşturulan DNA adduktlarının işlenmesi sırasında ara ürünler olarak da görünür. Sonuç olarak, bu ajanların çoğu için, yanıt faktörleri ile bağlanma etkileşimlerinin analizine ve onarım proteinlerine izin veren teknolojiler bilinmemektedir. Örneğin, DNA interstrand çapraz bağları (ICL’ler), replikasyon çatalı karşılaşmalarını takiben kırılmalara neden olabilir. Kanser kemoterapötikleri olarak yaygın olarak kullanılan ilaçlar tarafından oluşturulmasına rağmen, replikasyon proteinleri ile etkileşimlerini izlemek için herhangi bir metodoloji bulunmamaktadır.
Burada, bu zorlu adduct’larla çatal çarpışmalarına hücresel tepkiyi takip etme stratejimizi açıklıyoruz. Bir steroid antijenini, canlı hücrelerin çekirdeklerinde fotoaktivasyona bağımlı ICL’ler oluşturan psoralen’e bağladık. ICL’ler antijen etiketine karşı immünofloresan ile görselleştirildi. Etiket ayrıca iki antijenin yakın ilişkisini bildiren Yakınlık Ligasyon Testi’nde (PLA) bir ortak olabilir. PLA, etiketlenmiş ICL’lerle yakından ilişkili olan proteinleri olmayanlardan ayırt etmek için kullanıldı. ICL’lerle karşılaştıktan sonra tutulan replisome proteinleri tanımlamak ve kaybolan diğerlerini tanımlamak mümkündü. Bu yaklaşım, immünolojik olarak tespit edilebilen herhangi bir yapı veya DNA katkısı için geçerlidir.
Introduction
Çift iplikçik kopmalarına hücresel yanıt, kopmaları spesifik genomik bölgelere yönlendirmek için giderek daha güçlü yöntemlerin art arda gelmesi nedeniyle iyi belgelenmiştir 1,2,3. Konumun kesinliği, bölgede biriken ve DNA Hasar Yanıtına (DDR) katılan proteinlerin ve diğer faktörlerin kesin karakterizasyonunu sağlar, böylece kırılmaları onaran Homolog Olmayan Son Birleştirme (NHEJ) ve Homolog Rekombinasyon (HR) yollarını yönlendirir. Tabii ki, birçok kırılma, radyasyon ve belirli dizilere saldırmayan kimyasal türler gibi ajanlar tarafından tanıtılır4. Bununla birlikte, bunlar için uçları etiketleme ve yerelleştirme için uygun yapılara dönüştürebilen prosedürler mevcuttur 5,6. Kırılmalar, immünoglobulinin yeniden düzenlenmesi gibi biyolojik süreçlerle de ortaya çıkar ve son teknoloji, lokalizasyonlarına da izin verir7. Yanıt veren faktörler ve bu siteler arasındaki ilişki daha sonra belirlenebilir.
Kırılmalar ayrıca, doğal kırıcılar olmayan, ancak transkripsiyon ve replikasyon gibi DNA işlemlerini bozan bileşikler tarafından oluşturulan adduktların dolaylı bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bu tıkanıklıklara hücresel yanıtın bir özelliği olarak, belki onarım sırasında veya nükleaz saldırısına karşı savunmasız bir yapıyı tetikledikleri için oluşabilirler. Tipik olarak, addukt, mola ve yanıt veren faktörlerle ilişki arasındaki fiziksel ilişki çıkarımsaldır. Örneğin, ICL’ler sisplatin ve Mitomisin C8 gibi kemoterapötikler tarafından ve abazik bölgeler9’un bir reaksiyon ürünü olarak oluşturulur. ICL’ler, replikasyon çatalları10’a güçlü bloklar olarak bilinir, böylece nükleazlar11 tarafından bölünebilen çatalları durdurur. İplikçikler arasındaki kovalent bağlantı genellikle ara12,13 olarak zorunlu kırılmalara sahip yollar tarafından rahatlatılır ve replikasyon çatalı14’ü yeniden oluşturmak için homolog rekombinasyon gerektirir. Çoğu deneyde araştırmacı, bir replikasyon çatalının bir ICL ile çarpışmasının aşağı yönünde oluşan kırılmalara ilgi faktörlerinin tepkisini takip eder. Bununla birlikte, provokatif bir lezyonun lokalizasyonu için herhangi bir teknoloji bulunmadığından, replisome’un ve bileşen parçalarının ICL’ye yakınlığı ancak varsayılabilir.
Burada ICL’ler tarafından gösterilen, sekansa özgü olmayan kovalent katkılarla protein ilişkilerinin analizini sağlamak için bir strateji geliştirdik. Sistemimizde bunlar, binlerce yıldır cilt bozuklukları için terapötik olarak kullanılan fotoaktif bir doğal ürün olan psoralen tarafından tanıtılmaktadır15. Yaklaşımımız psoralenslerin iki önemli özelliğine dayanmaktadır. Birincisi, sisplatin veya Mitomisin C 8,16 gibi popüler bileşiklerin oluşturduğu% 10’dan azının aksine, adduktların% 90’ını aşabilen yüksek çapraz bağlantı oluşum sıklığıdır. İkincisi, bileşiğin çapraz bağlama kapasitesi kaybı olmadan konjugasyona erişilebilirliğidir. Trimetil psoralen’i kovalent olarak uzun zamandır kurulmuş bir immünoetiket olan Digoxigenin’e (Dig) bağladık. Bu, genomik DNA’daki psoralen adduktlarının Dig etiketinin immünoboyaması ile tespit edilmesini ve konvansiyonel immünofloresan17 ile görselleştirilmesini sağlar.
Bu reaktif, önceki çalışmamızda, DNA lifi bazlı bir tahlil16 kullanılarak ICL’lerle replikasyon çatalı karşılaşmalarının analizine uygulandı. Bu çalışmada, replikasyonun bozulmamış bir ICL’den sonra devam edebileceğini bulduk. Bu, replikasyon stresi ile aktive olan ATR kinazına bağlıydı. CMG replikatif helikazın yapısı göz önüne alındığında replikasyon yeniden başlatma beklenmiyordu. Bu, GINS kompleksinin (PSF1, 2, 3 ve SLD5’ten oluşan G) ve CDC45 (C)18’in proteinleri tarafından kilitlenen lider iplik sentezi için şablon ipliği etrafında ofset aralıklı bir halka oluşturan MCM hetero-heksamerinden (M) oluşur. Replikasyonun, ICL distal tarafında, replisome çarpışmasının yanına kadar yeniden başlayabileceği önerisi, replisome’un yapısında bir değişiklik yapılmasını savundu. Bir ICL ile karşılaşma sırasında hangi bileşenlerin yanıt verdiği sorusunu ele almak için, burada açıklanan yaklaşımı geliştirdik. Dig etiketini, ICL’nin replisome20’nin proteinleriyle yakın ilişkisini sorgulamak için Proximity Ligation Assays’da (PLA)19’da bir ortak olarak kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLA çok güçlü bir teknik olmasına rağmen, net ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çözülmesi gereken teknik kaygılar vardır. Antikorlar yüksek afinite ve özgüllükte olmalıdır. Ayrıca, spesifik olmayan arka plan sinyallerini mümkün olduğunca azaltmak önemlidir. Membranların ve hücresel kalıntıların arka plana katkıda bulunduğunu bulduk ve bunları mümkün olduğunca çıkardık. Sabitlemeden önce deterjan içeren tamponlarla yapılan yıkamalar ve sabitlemeden sonra metanol ile yık…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, kısmen, NIH, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, Amerika Birleşik Devletleri (Z01-AG000746-08) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. J.H., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakıfları (21708007 ve 31871365) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
- Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
- Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
- Galbiati, A., Beausejour, C., d’Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
- Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
- Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
- Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
- Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
- Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
- Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
- Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
- Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
- Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
- Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- O’Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
- Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
- Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
- Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
- Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
- Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
- Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).
- Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).
