Visualización de encuentros con replisoma con una lesión bloqueadora etiquetada con antígeno
Summary
Si bien las colisiones de horquilla de replicación con aductos de ADN pueden inducir roturas de doble cadena, se sabe menos sobre la interacción entre los replisomas y las lesiones de bloqueo. Hemos empleado el ensayo de ligadura de proximidad para visualizar estos encuentros y caracterizar las consecuencias para la composición replisómica.
Abstract
Existe una visión considerable de la respuesta celular a las roturas de doble cadena (DSB), inducidas por nucleasas, radiación y otros rompedores de ADN. En parte, esto refleja la disponibilidad de métodos para la identificación de los lugares de ruptura y la caracterización de los factores reclutados por los OSD en esas secuencias. Sin embargo, los DSB también aparecen como intermediarios durante el procesamiento de aductos de ADN formados por compuestos que no causan roturas directamente y no reaccionan en sitios de secuencia específicos. En consecuencia, para la mayoría de estos agentes, se desconocen las tecnologías que permiten el análisis de las interacciones de unión con factores de respuesta y proteínas de reparación. Por ejemplo, los enlaces cruzados entre cadenas de ADN (ICL) pueden provocar interrupciones después de los encuentros con la bifurcación de replicación. Aunque se forman por fármacos ampliamente utilizados como quimioterápicos del cáncer, no ha habido una metodología para monitorear sus interacciones con proteínas de replicación.
Aquí, describimos nuestra estrategia para seguir la respuesta celular a las colisiones de horquillas con estos aductos desafiantes. Vinculamos un antígeno esteroide al psoraleno, que forma ICL dependientes de fotoactivación en núcleos de células vivas. Las ICLs fueron visualizadas por inmunofluorescencia contra la etiqueta de antígeno. La etiqueta también puede ser un socio en el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) que informa la asociación cercana de dos antígenos. El PLA se explotó para distinguir las proteínas que estaban estrechamente asociadas con las ICL marcadas de las que no lo estaban. Fue posible definir proteínas replisomas que fueron retenidas después de encuentros con ICLs e identificar otras que se perdieron. Este enfoque es aplicable a cualquier estructura o aducto de ADN que pueda detectarse inmunológicamente.
Introduction
La respuesta celular a las roturas de doble cadena está bien documentada debido a una sucesión de métodos cada vez más potentes para dirigir las roturas a sitios genómicos específicos 1,2,3. La certeza de la ubicación permite una caracterización inequívoca de las proteínas y otros factores que se acumulan en el sitio y participan en la respuesta al daño del ADN (DDR), impulsando así las vías de unión final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) que reparan las roturas. Por supuesto, muchas roturas son introducidas por agentes como la radiación y las especies químicas que no atacan secuencias específicas4. Sin embargo, para estos hay procedimientos disponibles que pueden convertir los extremos en estructuras susceptibles de etiquetado y localización 5,6. Las roturas también son introducidas por procesos biológicos, como el reordenamiento de inmunoglobulinas,y la tecnología reciente también permite su localización7. La relación entre los factores que responden y esos sitios se puede determinar.
Las roturas también aparecen como una consecuencia indirecta de los aductos formados por compuestos que no son rompedores inherentes pero que interrumpen las transacciones de ADN, como la transcripción y la replicación. Pueden formarse como una característica de la respuesta celular a estas obstrucciones, tal vez durante la reparación o porque provocan una estructura que es vulnerable al ataque de nucleasas. Típicamente, la relación física entre el aducto, la ruptura y la asociación con los factores que responden es inferencial. Por ejemplo, las ICLs están formadas por quimioterápicos como cisplatino y mitomicina C8 y como producto de reacción de sitios abásicos9. Las ICL son bien conocidas como bloques potentes para las horquillas de replicación10, deteniendo así las horquillas que pueden ser escindidas por las nucleasas11. El enlace covalente entre hebras a menudo se alivia por vías que tienen rupturas obligadas como intermedias 12,13, lo que requiere una recombinación homóloga para reconstruir la horquilla de replicación14. En la mayoría de los experimentos, el investigador sigue la respuesta de los factores de interés a las roturas que se forman aguas abajo de la colisión de una horquilla de replicación con una ICL. Sin embargo, debido a que no ha habido tecnología para la localización de una lesión provocativa, la proximidad del replisoma y sus partes componentes a la ICL solo se puede asumir.
Hemos desarrollado una estrategia para permitir el análisis de asociaciones de proteínas con aductos covalentes no específicos de secuencia, ilustrados aquí por ICLs. En nuestro sistema, estos son introducidos por el psoraleno, un producto natural fotoactivo utilizado durante miles de años como terapéutico para los trastornos de la piel15. Nuestro enfoque se basa en dos características importantes de los psoralenos. El primero es su alta frecuencia de formación de reticulación, que puede superar el 90% de los aductos, en contraste con el menos del 10% formado por compuestos populares como el cisplatino o la mitomicina C 8,16. El segundo es la accesibilidad del compuesto a la conjugación sin pérdida de capacidad de reticulación. Hemos vinculado covalentemente el trimetilpsoraleno a la digoxigenina (Dig), un inmunotag establecido desde hace mucho tiempo. Esto permite la detección de los aductos de psoraleno en el ADN genómico por inmunotinción de la etiqueta Dig, y la visualización por inmunofluorescencia convencional17.
Este reactivo fue aplicado, en nuestro trabajo previo, al análisis de encuentros de horquilla de replicación con ICLs utilizando un ensayo basado en fibra de ADN16. En ese trabajo encontramos que la replicación podría continuar más allá de una ICL intacta. Esto dependía de la quinasa ATR, que se activa por estrés de replicación. El reinicio de la replicación fue inesperado dada la estructura de la helicasa replicativa CMG. Esto consiste en el heterohexámero MCM (M) que forma un anillo separado de desplazamiento alrededor de la hebra plantilla para la síntesis de la cadena principal que está bloqueada por las proteínas del complejo GINS (G, que consiste en PSF1, 2, 3 y SLD5) y CDC45 (C) 18. La propuesta de que la replicación podría reiniciarse en el lado de la ICL distal al lado de la colisión del replisoma abogaba por un cambio en la estructura del replisoma. Para abordar la cuestión de qué componentes estaban en el replisoma en el momento del encuentro con una CIT, desarrollamos el enfoque descrito aquí. Explotamos la etiqueta Dig como socio en Ensayos de Ligadura de Proximidad (PLA)19 para interrogar la estrecha asociación de la ICL con proteínas del replisoma20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque el PLA es una técnica muy potente, existen inquietudes técnicas que deben resolverse para obtener resultados claros y reproducibles. Los anticuerpos deben ser de alta afinidad y especificidad. Además, es importante reducir las señales de fondo no específicas tanto como sea posible. Hemos encontrado que las membranas y los desechos celulares contribuyen al fondo, y los hemos eliminado tanto como sea posible. Los lavados con detergente que contiene tampones antes de la fijación, y el lavado con metanol despué…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada, en parte, por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento, Estados Unidos (Z01-AG000746-08). J.H. cuenta con el apoyo de las Fundaciones Nacionales de Ciencias Naturales de China (21708007 y 31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
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