Visualização de Encontros de Replisome com uma Lesão de Bloqueio com Antígeno Marcado
Summary
Enquanto colisões de bifurcação de replicação com adutos de DNA podem induzir quebras de fita dupla, pouco se sabe sobre a interação entre replisomos e lesões de bloqueio. Empregamos o ensaio de ligadura de proximidade para visualizar esses encontros e caracterizar as consequências para a composição do replisome.
Abstract
Considerável conhecimento está presente na resposta celular a quebras de fita dupla (DSBs), induzidas por nucleases, radiação e outros quebradores de DNA. Em parte, isso reflete a disponibilidade de métodos para a identificação de locais de quebra e caracterização de fatores recrutados para DSBs nessas sequências. No entanto, os DSBs também aparecem como intermediários durante o processamento de adutos de DNA formados por compostos que não causam diretamente quebras e não reagem em locais específicos de sequência. Consequentemente, para a maioria desses agentes, tecnologias que permitem a análise de interações de ligação com fatores de resposta e proteínas de reparo são desconhecidas. Por exemplo, ligações cruzadas de DNA interstrand (ICLs) podem provocar quebras após encontros de bifurcação de replicação. Apesar de formados por fármacos amplamente utilizados como quimioterápicos do câncer, ainda não existe uma metodologia para monitorar suas interações com proteínas de replicação.
Aqui, descrevemos nossa estratégia para acompanhar a resposta celular a colisões de bifurcação com esses adutos desafiadores. Ligamos um antígeno esteroide ao psoraleno, que forma ICLs dependentes de fotoativação em núcleos de células vivas. As LCIs foram visualizadas por imunofluorescência contra o antígeno tag. A tag também pode ser parceira no Ensaio de Ligadura de Proximidade (PLA), que relata a associação próxima de dois antígenos. O PLA foi explorado para distinguir proteínas que estavam intimamente associadas com as ICLs marcadas daquelas que não estavam. Foi possível definir proteínas replisomes que foram retidas após encontros com ICLs e identificar outras que foram perdidas. Esta abordagem é aplicável a qualquer estrutura ou aduto de DNA que possa ser detectado imunologicamente.
Introduction
A resposta celular a quebras de fitas duplas está bem documentada devido a uma sucessão de métodos cada vez mais poderosos para direcionar quebras para sítios genômicos específicos 1,2,3. A certeza da localização permite a caracterização inequívoca de proteínas e outros fatores que se acumulam no local e participam da Resposta a Danos no DNA (DDR), conduzindo assim as vias de Junção Final Não Homóloga (NHEJ) e Recombinação Homóloga (HR) que reparam quebras. É claro que muitas quebras são introduzidas por agentes como radiação e espécies químicas que não atacam sequências específicas4. Entretanto, para estes existem procedimentos disponíveis que podem converter as extremidades em estruturas passíveis de marcação e localização 5,6. As quebras também são introduzidas por processos biológicos, como o rearranjo de imunoglobulinas, e tecnologia recente permite sua localização, assim como7. A relação entre os fatores de resposta e esses locais pode então ser determinada.
As quebras também aparecem como uma consequência indireta de adutos formados por compostos que não são disjuntores inerentes, mas interrompem transações de DNA, como transcrição e replicação. Eles podem ser formados como uma característica da resposta celular a essas obstruções, talvez durante o reparo ou porque provocam uma estrutura vulnerável ao ataque de nucleases. Tipicamente, a relação física entre o aduto, a quebra e a associação com fatores respondedores é inferencial. Por exemplo, as LCIs são formadas por quimioterápicos como cisplatina e mitomicina C8 e como produto reacional de sítios abásicos9. As ILPs são bem conhecidas como blocos potentes para bifurcações de replicação10, estancando assim garfos que podem ser clivados por nucleases11. A ligação covalente entre as fitas é frequentemente aliviada por vias que têm quebras obrigatórias como intermediários12,13, necessitando de recombinação homóloga para reconstruir a bifurcação de replicação 14. Na maioria dos experimentos, o investigador acompanha a resposta de fatores de interesse às quebras que se formam a jusante da colisão de uma bifurcação de replicação com uma ICL. Entretanto, como não há tecnologia para a localização de uma lesão provocativa, a proximidade do replisome, e de suas partes componentes, com a LCI só pode ser presumida.
Desenvolvemos uma estratégia para permitir a análise de associações de proteínas com adutos covalentes não sequenciais específicos, ilustrada aqui por ILPs. Em nosso sistema, estes são introduzidos pelo psoraleno, um produto natural fotoativo utilizado há milhares de anos como terapêutico para doenças de pele15. Nossa abordagem é baseada em duas características importantes dos psoralens. O primeiro é a alta frequência de formação de ligações cruzadas, que pode ultrapassar 90% dos adutos, em contraste com os menos de 10% formados por compostos populares como a cisplatina ou a mitomicina C 8,16. A segunda é a acessibilidade do composto à conjugação sem perda da capacidade de reticulação. Nós ligamos covalentemente o trimetil psoraleno à digoxigenina (Dig), um imunotag há muito estabelecido. Isso permite a detecção dos adutos psoralenos no DNA genômico por imunomarcação do tag Dig e visualização por imunofluorescênciaconvencional17.
Este reagente foi aplicado, em nosso trabalho anterior, na análise de encontros de bifurcação de replicação com ILCs usando um ensaio baseado em fibras de DNA16. Nesse trabalho, descobrimos que a replicação poderia continuar após uma ICL intacta. Isso foi dependente da quinase ATR, que é ativada pelo estresse de replicação. O reinício da replicação foi inesperado, dada a estrutura da helicase replicativa da CMG. Este consiste no hetero-hexâmero MCM (M) que forma um anel deslocado ao redor da fita molde para a síntese da fita principal que é bloqueada pelas proteínas do complexo GINS (G, consistindo de PSF1, 2, 3 e SLD5) e CDC45 (C)18. A proposta de que a replicação poderia ser reiniciada no lado da LCI distal ao lado da colisão do replisome defendia uma mudança na estrutura do replisome. Para abordar a questão de quais componentes estavam no replisome no momento do encontro com uma ICL, desenvolvemos a abordagem aqui descrita. Exploramos o tag Dig como parceiro em Ensaios de Ligadura de Proximidade (PLA)19 para interrogar a estreita associação da LCI com proteínas do replisome20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora o PLA seja uma técnica muito poderosa, existem preocupações técnicas que devem ser resolvidas para a obtenção de resultados claros e reprodutíveis. Os anticorpos devem ser de alta afinidade e especificidade. Além disso, é importante reduzir ao máximo os sinais de fundo não específicos. Descobrimos que membranas e detritos celulares contribuem para o fundo e os removemos o máximo possível. As lavagens com detergente contendo tampões antes da fixação, e a lavagem com metanol após a fixação ajudam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada, em parte, pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, National Institute on Aging, Estados Unidos (Z01-AG000746–08). J.H. é apoiado pela National Natural Science Foundations of China (21708007 e 31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
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