Визуализация ответных встреч с поражением, помеченным антигеном, блокирующим поражение
Summary
В то время как репликационные вилочные столкновения с аддуктами ДНК могут вызывать разрывы двойной цепи, меньше известно о взаимодействии между реплисомами и блокирующими поражениями. Мы использовали анализ лигирования близости, чтобы визуализировать эти встречи и охарактеризовать последствия для состава реплисом.
Abstract
Значительное понимание клеточного ответа на двухцепочечные разрывы (DSB), индуцированные нуклеазами, радиацией и другими разрушителями ДНК. Отчасти это отражает наличие методов идентификации участков разрыва и характеристику факторов, привлекаемых в ОРС в этих последовательностях. Однако DSB также появляются в качестве промежуточных продуктов при обработке аддуктов ДНК, образованных соединениями, которые непосредственно не вызывают разрывов и не реагируют на определенные участки последовательности. Следовательно, для большинства из этих агентов технологии, позволяющие анализировать связывающие взаимодействия с факторами ответа и белками репарации, неизвестны. Например, межцепочечные сшивки ДНК (ICL) могут провоцировать разрывы после встреч репликационной вилки. Несмотря на то, что они формируются препаратами, широко используемыми в качестве химиотерапии рака, не было методологии мониторинга их взаимодействия с репликационными белками.
Здесь мы описываем нашу стратегию отслеживания клеточного ответа на столкновения вилок с этими сложными аддуктами. Мы связали стероидный антиген с псораленом, который образует фотоактивационно-зависимые ICL в ядрах живых клеток. ICL визуализировали с помощью иммунофлуоресценции против метки антигена. Метка также может быть партнером в анализе бесконтактного лигирования (PLA), который сообщает о тесной связи двух антигенов. PLA использовали, чтобы отличить белки, которые были тесно связаны с мечеными ICL, от тех, которые не были связаны. Удалось определить реплисомные белки, которые были сохранены после встреч с ICL, и идентифицировать другие, которые были потеряны. Этот подход применим к любой структуре или аддукту ДНК, которые могут быть обнаружены иммунологически.
Introduction
Клеточная реакция на двухцепочечные разрывы хорошо задокументирована благодаря последовательности все более мощных методов направления разрывов к определенным участкам генома 1,2,3. Определенность местоположения позволяет однозначно охарактеризовать белки и другие факторы, которые накапливаются на участке и участвуют в реакции на повреждение ДНК (DDR), тем самым управляя путями негомологичного концевого соединения (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR), которые восстанавливают разрывы. Конечно, многие разрывы вводятся такими агентами, как радиация и химические вещества, которые не атакуют определенные последовательности4. Однако для них существуют процедуры, которые могут преобразовать концы в структуры, поддающиеся маркировке и локализации 5,6. Разрывы также вносятся биологическими процессами, такими как перестройка иммуноглобулинов, и последние технологии позволяют их локализовать, а также7. Затем можно определить взаимосвязь между реагирующими факторами и этими сайтами.
Разрывы также появляются как косвенное следствие аддуктов, образованных соединениями, которые не являются врожденными разрушителями, но нарушают транзакции ДНК, такие как транскрипция и репликация. Они могут быть сформированы как особенность клеточного ответа на эти препятствия, возможно, во время восстановления или потому, что они провоцируют структуру, которая уязвима для атаки нуклеаз. Как правило, физическая связь между аддуктом, разрывом и ассоциацией с реагирующими факторами является выводной. Например, ICL образуются химиотерапевтическими средствами, такими как цисплатин и митомицинС8, и в качестве продукта реакции основных сайтов9. ICL хорошо известны как мощные блоки репликационных вилок10, тем самым останавливая вилки, которые могут быть расщеплены нуклеазами11. Ковалентная связь между цепями часто облегчается путями, которые имеют облигатные разрывы в качестве промежуточныхпродуктов 12,13, что требует гомологичной рекомбинации для восстановления репликационной вилки14. В большинстве экспериментов исследователь следит за реакцией интересующих факторов на разрывы, которые образуются ниже по течению от столкновения репликационной вилки с ICL. Однако, поскольку не было никакой технологии локализации провокационного поражения, можно только предположить близость реплизомы и ее составных частей к ICL.
Мы разработали стратегию, позволяющую анализировать белковые ассоциации с непоследовательными специфическими ковалентными аддуктами, проиллюстрированными здесь ICL. В нашу систему они введены псораленом, фотоактивным натуральным продуктом, используемым на протяжении тысячелетий в качестве терапевтического средства для лечения кожных заболеваний15. Наш подход основан на двух важных особенностях псораленов. Во-первых, это их высокая частота образования сшивки, которая может превышать 90% аддуктов, в отличие от менее 10%, образованных популярными соединениями, такими как цисплатин или митомицин С 8,16. Во-вторых, доступность соединения к сопряжению без потери сшивающей способности. Мы ковалентно связываем триметилпсорален с дигоксигенином (Dig), давно установленной иммунометкой. Это позволяет обнаруживать аддукты псоралена в геномной ДНК с помощью иммуноокрашивания метки Dig и визуализации с помощью обычной иммунофлуоресценции17.
Этот реагент был применен в нашей предыдущей работе для анализа встреч репликационной вилки с ICL с использованием анализа на основе ДНК-волокна16. В этой работе мы обнаружили, что репликация может продолжаться после неповрежденного ICL. Это зависело от ATR-киназы, которая активируется репликационным стрессом. Перезапуск репликации был неожиданным, учитывая структуру репликативной геликазы CMG. Он состоит из гетерогексамера MCM (M), который образует кольцо со смещенным зазором вокруг матричной цепи для синтеза ведущей цепи, которая заблокирована белками комплекса GINS (G, состоящего из PSF1, 2, 3 и SLD5) и CDC45 (C) 18. Предположение о том, что репликация может быть возобновлена на стороне ICL дистальнее стороны столкновения реплисом, приводило доводы в пользу изменения структуры реплисомы. Чтобы ответить на вопрос о том, какие компоненты были в ответе во время встречи с ICL, мы разработали подход, описанный здесь. Мы использовали тег Dig в качестве партнера в анализах бесконтактного лигирования (PLA)19 для изучения тесной связи ICL с белками реплиомы20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя НОАК является очень мощным методом, существуют технические проблемы, которые необходимо решить, чтобы получить четкие и воспроизводимые результаты. Антитела должны обладать высоким сродством и специфичностью. Кроме того, важно максимально уменьшить количество неспецифических ф…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований NIH, Национального института старения, США (Z01-AG000746–08). J.H. поддерживается Национальными фондами естественных наук Китая (21708007 и 31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
- Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
- Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
- Galbiati, A., Beausejour, C., d’Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
- Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
- Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
- Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
- Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
- Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
- Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
- Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
- Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
- Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
- Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- O’Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
- Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
- Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
- Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
- Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
- Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
- Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).
- Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).
