Visualisering av replisome møter med et antigen merket blokkerende lesjon
Summary
Mens replikasjonsgaffelkollisjoner med DNA-addukter kan indusere dobbeltstrengbrudd, er mindre kjent om samspillet mellom replisomes og blokkerende lesjoner. Vi har benyttet nærhetsligeringsanalysen for å visualisere disse møtene og for å karakterisere konsekvensene for replisome sammensetning.
Abstract
Betydelig innsikt er til stede i den cellulære responsen på dobbeltstrengbrudd (DSB), indusert av nukleaser, stråling og andre DNA-brytere. Dette reflekterer blant annet tilgjengeligheten av metoder for identifisering av bruddsteder, og karakterisering av faktorer som rekrutteres til DSB ved disse sekvensene. DSB opptrer imidlertid også som mellomprodukter under behandlingen av DNA-addukter dannet av forbindelser som ikke direkte forårsaker brudd, og ikke reagerer på bestemte sekvenssteder. Følgelig er teknologier som tillater analyse av bindingsinteraksjoner med responsfaktorer og reparasjonsproteiner ukjente for de fleste av disse midlene. For eksempel kan DNA interstrand crosslinks (ICL) provosere pauser etter replikasjonsgaffelmøter. Selv om det dannes av legemidler som er mye brukt som kreftkjemoterapeutika, har det ikke vært noen metodikk for å overvåke deres interaksjoner med replikasjonsproteiner.
Her beskriver vi vår strategi for å følge den cellulære responsen på gaffelkollisjoner med disse utfordrende adduktene. Vi koblet et steroidantigen til psoralen, som danner fotoaktiveringsavhengige ICL i kjerner av levende celler. ICLene ble visualisert ved immunfluorescens mot antigenkoden. Taggen kan også være en partner i Proximity Ligation Assay (PLA) som rapporterer nær tilknytning av to antigener. PLA ble utnyttet til å skille proteiner som var nært forbundet med de merkede ICLene fra de som ikke var det. Det var mulig å definere replisome proteiner som ble beholdt etter møter med ICL og identifisere andre som gikk tapt. Denne tilnærmingen gjelder for enhver struktur eller DNA-addukt som kan detekteres immunologisk.
Introduction
Den cellulære responsen på dobbeltstrengbrudd er godt dokumentert på grunn av en rekke stadig kraftigere metoder for å lede brudd til spesifikke genomiske steder 1,2,3. Lokaliseringssikkerheten muliggjør entydig karakterisering av proteiner og andre faktorer som akkumuleres på stedet og deltar i DNA-skaderesponsen (DDR), og derved driver de ikke-homologe endeforbindelsesveiene (NHEJ) og homologe rekombinasjonsveier (HR) som reparerer brudd. Selvfølgelig introduseres mange pauser av midler som stråling og kjemiske arter som ikke angriper bestemte sekvenser4. For disse er det imidlertid prosedyrer tilgjengelig som kan konvertere endene til strukturer som er egnet for merking og lokalisering 5,6. Pauser blir også introdusert av biologiske prosesser, for eksempel immunoglobulinomlegging, og nyere teknologi tillater lokalisering, samt7. Forholdet mellom responderende faktorer og disse nettstedene kan da bestemmes.
Pauser vises også som en indirekte konsekvens av addukter dannet av forbindelser som ikke er iboende brytere, men forstyrrer DNA-transaksjoner som transkripsjon og replikasjon. De kan dannes som en funksjon av den cellulære responsen på disse hindringene, kanskje under reparasjon eller fordi de provoserer en struktur som er sårbar for nukleaseangrep. Vanligvis er det fysiske forholdet mellom addukten, pausen og foreningen med responderende faktorer inferensiell. For eksempel dannes ICL av kjemoterapeutika som cisplatin og mitomycinC8 og som et reaksjonsprodukt av abasiske steder9. ICL er velkjent som potente blokker til replikasjonsgafler10, og stopper dermed gafler som kan spaltes av nukleaser11. Den kovalente koblingen mellom tråder avlastes ofte av veier som har obligatoriske brudd som mellomprodukter12,13, noe som nødvendiggjør homolog rekombinasjon for å gjenoppbygge replikasjonsgaffelen 14. I de fleste eksperimenter følger etterforskeren responsen av faktorer av interesse for bruddene som dannes nedstrøms for kollisjonen av en replikasjonsgaffel med en ICL. Men fordi det ikke har vært noen teknologi for lokalisering av en provoserende lesjon, kan nærheten til replisome, og dens bestanddeler, til ICL bare antas.
Vi har utviklet en strategi for å muliggjøre analyse av proteinassosiasjoner med ikke-sekvensspesifikke kovalente addukter, her illustrert ved ICL. I vårt system blir disse introdusert av psoralen, et fotoaktivt naturlig produkt som brukes i tusenvis av år som terapeutisk for hudsykdommer15. Vår tilnærming er basert på to viktige trekk ved psoralener. Den første er deres høye frekvens av tverrbindingsdannelse, som kan overstige 90% av addukter, i motsetning til mindre enn 10% dannet av populære forbindelser som cisplatin eller Mitomycin C 8,16. Den andre er tilgjengeligheten av forbindelsen til konjugering uten tap av tverrbindingskapasitet. Vi har kovalent koblet trimetylpsoralen til Digoxigenin (Dig), en lenge etablert immunotag. Dette muliggjør påvisning av psoralenadduktene i genomisk DNA ved immunfarging av Dig-taggen, og visualisering ved konvensjonell immunfluorescens17.
Dette reagenset ble brukt i vårt tidligere arbeid til analyse av replikasjonsgaffelmøter med ICL ved bruk av en DNA-fiberbasert analyse16. I det arbeidet fant vi at replikering kunne fortsette forbi en intakt ICL. Dette var avhengig av ATR-kinasen, som aktiveres ved replikasjonsstress. Replikasjonsstarten var uventet gitt strukturen til CMG-replikerende helikase. Dette består av MCM hetero-hexamer (M) som danner en offset gapped ring rundt malstrengen for ledende strengsyntese som er låst av proteinene i GINS-komplekset (G, bestående av PSF1, 2, 3 og SLD5) og CDC45 (C) 18. Forslaget om at replikasjon kunne starte på siden av ICL distalt til siden av den replikative kollisjonen argumenterte for en endring i strukturen til replisome. For å ta opp spørsmålet om hvilke komponenter som var i svaret på tidspunktet for møtet med en ICL, utviklet vi tilnærmingen beskrevet her. Vi utnyttet Dig-taggen som partner i Proximity Ligation Assays (PLA)19 for å undersøke ICLs nære tilknytning til proteiner i replisome20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om PLA er en veldig kraftig teknikk, er det tekniske problemer som må løses for å oppnå klare og reproduserbare resultater. Antistoffene må ha høy affinitet og spesifisitet. Videre er det viktig å redusere de uspesifikke bakgrunnssignalene så mye som mulig. Vi har funnet ut at membraner og cellulært rusk bidrar til bakgrunnen, og vi har fjernet dem så mye som mulig. Vask med vaskemiddel som inneholder buffere før fiksering, og vask med metanol etter festing bidrar til å redusere den uspesifikke bindingen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble delvis støttet av NIHs intramurale forskningsprogram, National Institute on Aging, USA (Z01-AG000746-08). JH støttes av National Natural Science Foundations of China (21708007 og 31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
- Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
- Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
- Galbiati, A., Beausejour, C., d’Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
- Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
- Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
- Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
- Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
- Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
- Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
- Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
- Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
- Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
- Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- O’Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
- Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
- Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
- Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
- Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
- Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
- Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).
- Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).
