Summary

Интравитреальная инъекция и количественная оценка параметров инфекции в мышиной модели бактериального эндофтальмита

Published: February 06, 2021
doi:

Summary

Здесь описан метод интравитреальной инъекции и последующей бактериальной количественной оценки в мышиной модели бактериального эндофтальмита. Этот протокол может быть расширен для измерения иммунных реакций хозяина и бактериальной и экспрессии генов-хозяина.

Abstract

Внутриглазные бактериальные инфекции представляют опасность для зрения. Исследователи используют модели животных для исследования принимающих и бактериальных факторов и путей иммунного ответа, связанных с инфекцией, для выявления жизнеспособных терапевтических целей и тестирования препаратов для предотвращения слепоты. Метод внутривитреальной инъекции используется для инъекций организмов, лекарств или других веществ непосредственно в стекловидную полость в задней части глаза. Здесь мы продемонстрировали этот метод инъекций, чтобы инициировать инфекцию в глазу мыши и метод количественной оценки внутриглазных бактерий. Bacillus cereus выращивался в жидком средстве инфузии сердца мозга в течение 18 часов и перерасходулся в концентрацию 100 единиц формирования колонии (CFU)/0,5 МЛ. Мышь C57BL/6J была анестезирована с помощью комбинации кетамина и ксилазина. Используя микроинжектор пиколитера и стеклянные капиллярные иглы, 0,5 мкл подвески Bacillus был введен в середине стекловидного глаза мыши. Контралатеральный контрольный глаз либо вводили стерильными средствами (хирургический контроль), либо не вводили (абсолютный контроль). В 10 часов после заражения мышей усыпляли, а глаза собирали с помощью стерильных хирургических пинцетов и помещали в трубку, содержащую стерильные PBS 400 МЛ и 1 мм стерильные стеклянные бусины. Для анализов ELISAs или миелопероксидазы в трубки был добавлен ингибитор протеиназы. Для извлечения РНК был добавлен соответствующий буфер лиза. Глаза гомогенизировались в тканевом гомогенизаторе в течение 1-2 минут. Гомогенаты были последовательно разбавлены 10 раз в PBS и трек разбавленных на агар пластин. Остальные гомогенаты хранились при -80 градусов по Цельсию для дополнительных анализов. Плиты были инкубированы в течение 24 часов и CFU на глаз был количественно. Эти методы приводят к воспроизводимым инфекциям в глазах мыши и облегчают количественную оценку жизнеспособных бактерий, иммунного ответа хозяина и омиков экспрессии генов хозяина и бактерий.

Introduction

Бактериальный эндофтальмит является разрушительной инфекцией, которая вызывает воспаление, и, если не лечить должным образом, может привести к потере зрения или слепоты. Эндофтальмит является результатом проникновения бактерий ввнутреннюю часть глаза 1,2,3,4,5. Оказавшись в глазу, бактерии размножаются, производят токсины и другие вредные факторы, и может привести к необратимым повреждениям тонких клеток сетчатки и тканей. Повреждение глаз также может быть вызвано воспалением, из-за активации воспалительных путей, ведущих к воспалительному притокуклеток в внутреннюю часть глаза 1,5,6. Эндофтальмит может возникнуть после внутриглазной хирургии (послеоперационной), проникающей травмы глаза (посттравматического), или от метастатического распространения бактерий в глаз из другого анатомического участка (эндогенного)7,8,9,10. Лечение бактериального эндофтальмита включает антибиотики, противовоспалительные препараты или хирургическоевмешательство 3,4,11. Даже с этими процедурами, зрение или сам глаз могут быть потеряны. Визуальный прогноз после бактериального эндофтальмита обычно варьируется в зависимости от эффективности лечения, остроты зрения при презентации и вирулентности инфекционного организма.

Bacillus cereus (B. cereus) является одним из основных бактериальных патогенов, который вызывает посттравматическийэндофтальмит 7,12. Большинство случаев эндофтальмита B. cereus имеют быстрый курс, который может привести к слепоте в течение нескольких дней. Отличительными чертами эндофтальмита B. cereus являются быстро развивающееся внутриглазное воспаление, боль в глазах, быстрая потеря остроты зрения и лихорадка. B. cereus быстро растет в глазу по сравнению с другими бактериями, которые обычно вызываютглазные инфекции 2,4,12 и обладает многими факторами вирулентности. Таким образом, окно для успешного терапевтическоговмешательства относительно короткое 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Лечение этой инфекции, как правило, успешно в лечении эндофтальмита, вызванного другими менее вирулентных патогенов, но B. cereus эндофтальмит обычно приводит к более чем 70% пациентов, страдающих от значительной потери зрения. Около 50% из этих пациентов проходят evisceration или enucleation инфицированногоглаза 7,16,22,23. Разрушительный и быстрый характер эндофтальмита B. cereus требует немедленного и надлежащего лечения. Недавний прогресс в различение основных механизмов развития болезни определили потенциальные цели длявмешательства 19,26,27. Экспериментальные модели мыши B. cereus эндофтальмит продолжают быть полезными в распознавании механизмов инфекции и тестирования потенциальных терапевтических средств, которые могут предотвратить потерю зрения.

Экспериментальная внутриглазная инфекция мышей с B. cereus была инструментальной моделью для понимания бактериальных и принимающих факторов, а также их взаимодействий, во время эндофтальмита28. Эта модель имитирует посттравматическое или послеоперационное событие, при котором бактерии вводятся в глаз во время травмы. Эта модель очень воспроизводится и была полезна для тестирования экспериментальной терапии и предоставления данныхдля улучшения стандарта ухода 1,6,19,29,30. Как и многие другие модели инфекции, эта модель позволяет осуществлять независимый контроль над многими параметрами инфекции и позволяет эффективно и воспроизводимое обследование исходов инфекции. Исследования в аналогичной модели у кроликов за последние несколько десятилетий изучили влияние факторов вирулентности B. cereus в глазу 2,4,13,14,31. Путем впрыскивать напряжения мутанта B. cereus нуждаясь индивидуальных или множественных факторах вирулентности, вклад этих факторов вирулентности к суровости заболевания можно измерить исходами such as концентрация бактерий на по-разному часах postinfection или потеря визуальнофункции 13,14,27,31,32. Кроме того, принимающие факторы были изучены в этой модели, заражая нокаутом штаммов мыши не хватаетконкретных воспалительных факторов хозяина 26,29,33,34,35. Модель также полезна для тестирования потенциальных методов лечения этого заболевания путем введения новых соединений в глаз послезаражения 30,36. В этой рукописи мы описываем подробный протокол, который включает в себя заражение мышеловки B. cereus,сбор глаз после инфекции, количественную оценку внутриглазной бактериальной нагрузки и сохранение образцов для анализа дополнительных параметров тяжести заболевания.

Protocol

Все процедуры были выполнены в соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии Заявление для использования животных в офтальмологических и исследования зрения. Протоколы были одоб…

Representative Results

Создание воспроизводимой инокулы и точность процедуры внутривитреальной инъекции являются ключевыми шагами в разработке моделей микробного эндофтальмита. Здесь мы продемонстрировали процедуру внутривитреальной инъекции с помощью Грам-положительного Bacillus cereus. Мы ввели 100 CFU/0,5 ?…

Discussion

Даже при наличии мощных антибиотиков, противовоспалительных препаратов и витректомии, бактериальный эндофтальмит может ослепить пациента. Клинические исследования были полезны в изучении эндофтальмита; однако экспериментальные модели эндофтальмита обеспечивают быстрые и воспроиз…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят д-р Фэн Ли и Марк Диттмар (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Дин А. МакГи глаз институт, Оклахома-Сити, OK, США) за их помощь. Наше исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения гранты R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, и R01EY024140. Наше исследование также было поддержано P30EY21725 (грант NIH CORE для живой визуализации и анализа животных, молекулярной биологии и клеточной визуализации). Наши исследования также были поддержаны NEI Vision Science Pre-докторской программы стажера 5T32EY023202, пресвитерианского фонда здравоохранения научно-исследовательской поддержки гранта, а также неограниченный грант декан а. МакГи глаз института исследований для предотвращения слепоты.

Materials

2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA

References

  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
  3. Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
  4. Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
  5. Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
  6. Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
  7. Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
  8. Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
  9. Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
  10. Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
  11. Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
  12. Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
  13. Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
  14. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
  15. Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
  16. Cowan, C. L., Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
  17. Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
  18. Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
  19. Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
  20. Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
  21. Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
  22. David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
  23. Vahey, J. B., Flynn, H. W. Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
  24. Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
  25. Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
  26. Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
  27. Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
  28. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  29. Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
  30. LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
  31. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
  32. Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
  33. Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
  34. Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
  35. Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
  36. Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
  37. LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
  38. Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
  39. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  40. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
  41. Beyer, T. L., O’Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
  42. Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
  43. Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
  44. Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
  45. Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
  46. Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
  47. Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
  48. Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
  49. Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).

Play Video

Cite This Article
Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).

View Video