الحقن داخل القلبية وكمية من المعلمات العدوى في نموذج الماوس من التهاب Endophthalmitis البكتيرية
Summary
نحن نصف هنا طريقة الحقن داخل في الواقع والكمية البكتيرية اللاحقة في نموذج الماوس من التهاب بطانة الرحم البكتيرية. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لقياس الاستجابات المناعية المضيفة والبكتيرية والمضيفة الجينات التعبير.
Abstract
الالتهابات البكتيرية داخل العين تشكل خطرا على الرؤية. يستخدم الباحثون نماذج حيوانية للتحقيق في العوامل المضيفة والبكتيرية ومسارات الاستجابة المناعية المرتبطة بالعدوى لتحديد الأهداف العلاجية القابلة للتطبيق واختبار الأدوية لمنع العمى. وتستخدم تقنية الحقن داخل الجسم لحقن الكائنات الحية، والمخدرات، أو غيرها من المواد مباشرة في تجويف الزجاجة في الجزء الخلفي من العين. هنا، أظهرنا تقنية الحقن هذه لبدء العدوى في عين الماوس وتقنية تحديد البكتيريا داخل العين. نمت عصيات cereus في الدماغ ضخ القلب وسائل الإعلام السائلة لمدة 18 ساعة و resuspended إلى تركيز 100 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU)/0.5 μL. تم تخدير فأر C57BL/6J باستخدام مزيج من الكيتامين والزيلازين. باستخدام الحقن المجهري البيوليتر والإبر الشعرية الزجاجية، تم حقن 0.5 ميكرولتر من تعليق عصيات في الزجاج الزجاجي منتصف عين الماوس. أما حقن العين التحكم في الاضلاع مع وسائل الاعلام العقيمة (السيطرة الجراحية) أو لم يتم حقن (السيطرة المطلقة). وفي 10 ساعات بعد الإصابة، تم قتل الفئران، وتم حصاد العيون باستخدام ملاقط جراحية معقمة ووضعت في أنبوب يحتوي على PBS معقم 400 ميكرولتر والخرز الزجاجي المعقم 1 ملم. بالنسبة لـ ELISAs أو مقايسات النخاع ، تمت إضافة مثبط البروتينات إلى الأنابيب. لاستخراج RNA، تمت إضافة المخزن المؤقت تحلل المناسبة. تم التجانس العينين في التجانس الأنسجة لمدة 1-2 دقيقة. تم تخفيف المتجانس بشكل متسلسل 10 أضعاف في برنامج تلفزيوني وتتبع المخفف على لوحات أجار. تم تخزين ما تبقى من المتجانس في -80 درجة مئوية لم مقايسات إضافية. تم احتضان اللوحات لمدة 24 ساعة وتم تحديد كمية CFU لكل عين. هذه التقنيات تؤدي إلى التهابات قابلة للتكرار في عيون الماوس وتسهيل كمية البكتيريا القابلة للحياة ، والاستجابة المناعية المضيفة ، و omics للتعبير الجيني المضيف والبكتيري.
Introduction
التهاب بطانة الدماغ البكتيري هو عدوى مدمرة تسبب الالتهاب ، وإذا لم يتم علاجه بشكل صحيح ، يمكن أن يؤدي إلى فقدان البصر أو العمى. نتائج Endophthalmitis من دخول البكتيريا إلى المناطق الداخلية للعين1,2,3,4,5. مرة واحدة في العين، والبكتيريا تكرار، وإنتاج السموم وغيرها من العوامل الضارة، ويمكن أن يسبب ضررا لا رجعة فيه لخلايا الشبكية الحساسة والأنسجة. يمكن أن يكون الضرر العيني أيضا بسبب التهاب، وذلك بسبب تنشيط الممرات الالتهابية مما يؤدي إلى تدفق الخلايا الالتهابية في المناطق الداخلية من العين1,5,6. يمكن أن يحدث التهاب الأنف بعد جراحة داخل العين (بعد العملية), إصابة اختراق للعين (ما بعد الصدمة), أو من انتشار النقيلي للبكتيريا في العين من موقع تشريحي مختلف (الذاتية)7,8,9,10. تشمل علاجات التهاب إندورفم البكتيرية المضادات الحيوية أو الأدوية المضادة للالتهابات أو التدخل الجراحي3،4،11. حتى مع هذه العلاجات، قد تضيع الرؤية أو العين نفسها. التشخيص البصري بعد التهاب بطانة الأوعية البكتيرية عموما يختلف تبعا لفعالية العلاج، وحدة البصرية في العرض، وفوعة الكائن الذي يصيب.
عصيات cereus (B. cereus) هي واحدة من مسببات الأمراض البكتيرية الرئيسية التي تسبب التهاب endophthalmitis ما بعد الصدمة7,12. غالبية حالات التهاب إندورفان ب. cereus لها مسار سريع، والتي يمكن أن تؤدي إلى العمى في غضون أيام قليلة. السمات المميزة لB. التهاب بطانة الأوعية الدموية تشمل تطور سريع التهاب داخل العين, ألم العين, فقدان سريع للبصر، والحمى. B. cereus ينمو بسرعة في العين مقارنة مع البكتيريا الأخرى التي تسبب عادة التهابات العين2,4,12 وتمتلك العديد من عوامل الفوعة. ولذلك، فإن نافذة التدخل العلاجي الناجح قصيرة نسبيا1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21، 22، 23، 24، 25. عادة ما تنجح علاجات هذه العدوى في علاج التهاب إندورفوم الناجم عن مسببات الأمراض الأخرى الأقل ضراوة ، ولكن التهاب إندورفان ب. cereus يؤدي عادة إلى أكثر من 70٪ من المرضى الذين يعانون من فقدان كبير للرؤية. حوالي 50٪ من هؤلاء المرضى الخضوع لـ evisceceration أو enucleation العين المصابة7,16,22,23. الطبيعة المدمرة والسريعة لـ B. cereus endophthalmitis تستدعي العلاج الفوري والسليم. وقد حدد التقدم المحرز مؤخرا في تمييز الآليات الأساسية لتطوير الأمراض الأهداف المحتملة للتدخل19،26،27. نماذج الماوس التجريبية من B. cereus endophthalmitis لا تزال مفيدة في تمييز آليات العدوى واختبار العلاجات المحتملة التي قد تمنع فقدان البصر.
كانت العدوى التجريبية داخل العين للفئران مع B. cereus نموذجًا أساسيًا لفهم العوامل البكتيرية والمضيفة ، بالإضافة إلى تفاعلاتها ، أثناء التهاب إندورف28. يحاكي هذا النموذج حدث ما بعد الصدمة أو ما بعد الجراحة، حيث يتم إدخال البكتيريا في العين أثناء الإصابة. هذا النموذج هو استنساخ للغاية وكان مفيدا لاختبار العلاجات التجريبية وتوفير البيانات لتحسين مستوى الرعاية1,6,19,29,30. مثل العديد من نماذج العدوى الأخرى، يسمح هذا النموذج للسيطرة المستقلة على العديد من المعلمات من العدوى، وتمكن من فحص كفاءة واستنساخ نتائج العدوى. وقد درست الدراسات في نموذج مماثل في الأرانب على مدى العقود القليلة الماضية آثار ب. عوامل الفوعة cereus في العين2,4,13,14,31. عن طريق حقن ب. cereus سلالات متحولة تفتقر إلى عوامل الفوعة الفردية أو متعددة، يمكن قياس مساهمة هذه العوامل الفوعة في شدة المرض من خلال نتائج مثل تركيز البكتيريا في ساعات مختلفة من ما بعد الإصابة أو فقدان وظيفة بصرية13،14،27،31،32. وبالإضافة إلى ذلك، تم فحص عوامل المضيف في هذا النموذج عن طريق إصابة سلالات الماوس بالضربة القاضية تفتقر إلى عوامل المضيف التهابية محددة26،29،33،34،35. النموذج هو أيضا مفيدة لاختبار العلاجات المحتملة لهذا المرض عن طريق حقن مركبات جديدة في العين بعد العدوى30,36. في هذه المخطوطة، نحن وصف بروتوكول مفصل يتضمن إصابة عين الماوس بـ B. cereus، حصاد العين بعد العدوى، وتحديد كمية الحمل البكتيري داخل العين، والحفاظ على العينات لمقايس معلمات إضافية لشدة المرض.
Protocol
Representative Results
Discussion
حتى مع توافر المضادات الحيوية القوية ، والأدوية المضادة للالتهابات ، وجراحة استئصال فيريك ، يمكن أن يؤدي التهاب بطانة الأوعية البكتيرية إلى تعمية المريض. كانت الدراسات السريرية مفيدة في دراسة التهاب إندورفوم. ومع ذلك، فإن النماذج التجريبية من endophthalmitis توفر نتائج سريعة وقابلة للتكرار يمك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفان الدكتور فنغ لي ومارك ديتمار (أوهسك P30 الحية تصوير الحيوان الأساسية، عميد معهد أ. ماكغي للعيون، أوكلاهوما سيتي، OK، الولايات المتحدة الأمريكية) على مساعدتهم. وقد تم دعم أبحاثنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح R01EY028810، R01EY028066، R01EY025947، وR01EY024140. كما تم دعم أبحاثنا من قبل P30EY21725 (منحة NIH CORE لتصوير الحيوانات الحية وتحليلها، والبيولوجيا الجزيئية، والتصوير الخلوي). كما تم دعم بحثنا من قبل برنامج التدريب ما قبل الدكتوراه في مجال الرؤية في NEI 5T32EY023202، ومنحة دعم أبحاث مؤسسة الصحة المشيخية، ومنحة غير مقيدة لعميد معهد أ. ماكغي للعيون من البحوث للوقاية من العمى.
Materials
| 2-20 µL pipette | RANIN | L0696003G | NA |
| 37oC Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | NA |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 90003-032 | NA |
| Cell Microinjector | MicroData Instrument, Inc. | PM2000 | NA |
| Fine tip forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-122 | NA |
| Glass beads 1.0 mm | BioSpec | 11079110 | NA |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | NB-I2400 | NA |
| Microcapillary Pipets 5 Microliters | Kimble | 71900-5 | NA |
| Micro-Pipette Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | NA |
| Microscope Axiostar Plus | Zeiss | NA | |
| Microscope OPMI Lumera | Zeiss | NA | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | NA |
| Multichannel pipette 30-300 µL | Biohit | 15626090 | NA |
| Multichannel pipette 5-100 µL | Biohit | 9143724 | NA |
| Needle/Pipette Puller | Kopf | 730 | NA |
| PBS | GIBCO | 1897315 | Molecular grade |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Molecular grade |
| Reverse action forceps | Katena | K5-8228 | NA |
References
- Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
- Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Pathogenesis of gram-positive bacterial endophthalmitis. Infection and Immunity. 67 (7), 3348-3356 (1999).
- Durand, M. L. Bacterial and Fungal Endophthalmitis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (3), 597-613 (2017).
- Callegan, M. C., Engelbert, M., Parke, D. W., Jett, B. D., Gilmore, M. S. Bacterial endophthalmitis: Epidemiology, therapeutics, and bacterium-host interactions. Clinical Microbiology Reviews. 15 (1), 111-124 (2002).
- Livingston, E. T., Mursalin, M. H., Callegan, M. C. A Pyrrhic Victory: The PMN Response to Ocular Bacterial Infections. Microorganisms. 7 (11), 537 (2019).
- Ramadan, R. T., Moyer, A. L., Callegan, M. C. A role for tumor necrosis factor-alpha in experimental Bacillus cereus endophthalmitis pathogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (10), 4482-4489 (2008).
- Davey, R. T., Tauber, W. B. Posttraumatic endophthalmitis: The emerging role of Bacillus cereus infection. Reviews of Infectious Dissease. 9 (1), 110-123 (1987).
- Ramappa, M., et al. An outbreak of acute post-cataract surgery Pseudomonas sp. endophthalmitis caused by contaminated hydrophilic intraocular lens solution. Ophthalmology. 119 (3), 564-570 (2012).
- Coburn, P. S., et al. Bloodstream-To-Eye Infections Are Facilitated by Outer Blood-Retinal Barrier Dysfunction. PLoS One. 11 (5), 015560 (2016).
- Ness, T., Pelz, K., Hansen, L. L. Endogenous endophthalmitis: Microorganisms, disposition and prognosis. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (8), 852-856 (2007).
- Novosad, B. D., Callegan, M. C. Severe bacterial endophthalmitis: Towards improving clinical outcomes. Expert Review of Ophthalmology. 5 (5), 689-698 (2010).
- Mursalin, M. H., Livingston, E. T., Callegan, M. C. The cereus matter of Bacillus endophthalmitis. Experimental Eye Research. 193, 107959 (2020).
- Callegan, M. C., et al. Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infection and Immunity. 71 (6), 3116-3124 (2003).
- Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., Wong, A. C. Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infection and Immunity. 63 (2), 632-639 (1995).
- Callegan, M. C., et al. Contribution of membrane-damaging toxins to Bacillus endophthalmitis pathogenesis. Infection and Immunity. 70 (10), 5381-5389 (2002).
- Cowan, C. L., Madden, W. M., Hatem, G. F., Merritt, J. C. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Annals of Ophthalmology. 19 (2), 65-68 (1987).
- Callegan, M. C., et al. Virulence factor profiles and antimicrobial susceptibilities of ocular Bacillus isolates. Current Eye Research. 31 (9), 693-702 (2006).
- Callegan, M. C., et al. Bacillus endophthalmitis: Roles of bacterial toxins and motility during infection. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3233-3238 (2005).
- Mursalin, M. H. Bacillus S-layer-mediated innate interactions during endophthalmitis. Frontiers in Immunology. 11 (215), (2020).
- Moyer, A. L., Ramadan, R. T., Novosad, B. D., Astley, R., Callegan, M. C. Bacillus cereus-induced permeability of the blood-ocular barrier during experimental endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3783-3793 (2009).
- Callegan, M. C., et al. Efficacy of vitrectomy in improving the outcome of Bacillus cereus endophthalmitis. Retina. 31 (8), 1518-1524 (2011).
- David, D. B., Kirkby, G. R., Noble, B. A. Bacillus cereus endophthalmitis. British Journal of Ophthalmology. 78 (7), 577-580 (1994).
- Vahey, J. B., Flynn, H. W. Results in the management of Bacillus endophthalmitis. Ophthalmic Surgery. 22 (11), 681-686 (1991).
- Wiskur, B. J., Robinson, M. L., Farrand, A. J., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Toward improving therapeutic regimens for Bacillus endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (4), 1480-1487 (2008).
- Alfaro, D. V., et al. Experimental Bacillus cereus post-traumatic endophthalmitis and treatment with ciprofloxacin. British Journal of Ophthalmology. 80 (8), 755-758 (1996).
- Coburn, P. S., et al. TLR4 modulates inflammatory gene targets in the retina during Bacillus cereus endophthalmitis. BMC Ophthalmology. 18 (1), 96 (2018).
- Mursalin, M. H., et al. S-layer Impacts the Virulence of Bacillus in Endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (12), 3727-3739 (2019).
- Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
- Parkunan, S. M., et al. CXCL1, but not IL-6, significantly impacts intraocular inflammation during infection. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1125-1134 (2016).
- LaGrow, A. L., et al. A Novel Biomimetic Nanosponge Protects the Retina from the Enterococcus faecalis Cytolysin. mSphere. 2 (6), 00335 (2017).
- Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., Wong, A. C. Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis. Infection and Immunity. 68 (9), 5269-5276 (2000).
- Callegan, M. C., et al. The role of pili in Bacillus cereus intraocular infection. Experimental Eye Research. 159, 69-76 (2017).
- Miller, F. C., et al. Targets of immunomodulation in bacterial endophthalmitis. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100763 (2019).
- Parkunan, S. M., Astley, R., Callegan, M. C. Role of TLR5 and flagella in Bacillus intraocular infection. PLoS One. 9 (6), 100543 (2014).
- Parkunan, S. M., et al. Unexpected roles for Toll-Like receptor 4 and TRIF in intraocular infection with Gram-positive bacteria. Infection and Immunity. 83 (10), 3926-3936 (2015).
- Coburn, P. S., et al. Disarming Pore-Forming Toxins with Biomimetic Nanosponges in Intraocular Infections. mSphere. 4 (3), 00262-00319 (2019).
- LaGrow, A., et al. Biomimetic nanosponges augment gatifloxacin in reducing retinal damage during experimental MRSA endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (9), 4632 (2019).
- Novosad, B. D., Astley, R. A., Callegan, M. C. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 in experimental Bacillus cereus endophthalmitis. PLoS One. 6 (12), 28619 (2011).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution in the mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (3), 1109-1112 (2006).
- Beyer, T. L., O’Donnell, F. E., Goncalves, V., Singh, R. Role of the posterior capsule in the prevention of postoperative bacterial endophthalmitis: experimental primate studies and clinical implications. British Journal of Ophthalmology. 69 (11), 841-846 (1985).
- Tucker, D. N., Forster, R. K. Experimental bacterial endophthalmitis. Archives of Ophthalmology. 88 (6), 647-649 (1972).
- Alfaro, D. V., et al. Experimental pseudomonal posttraumatic endophthalmitis in a swine model. Treatment with ceftazidime, amikacin, and imipenem. Retina. 17 (2), 139-145 (1997).
- Silverstein, A. M., Zimmerman, L. E. Immunogenic endophthalmitis produced in the guinea pig by different pathogenetic mechanisms. American Journal of Ophthalmology. 48 (5), 435-447 (1959).
- Ravindranath, R. M., Hasan, S. A., Mondino, B. J. Immunopathologic features of Staphylococcus epidermidis-induced endophthalmitis in the rat. Current Eye Research. 16 (10), 1036-1043 (1997).
- Kumar, A., Singh, C. N., Glybina, I. V., Mahmoud, T. H., Yu, F. S. Toll-like receptor 2 ligand-induced protection against bacterial endophthalmitis. The Journal of Infectious Diseases. 201 (2), 255-263 (2010).
- Mylonakis, E., et al. The Enterococcus faecalis fsrB gene, a key component of the fsr quorum-sensing system, is associated with virulence in the rabbit endophthalmitis model. Infection and Immunity. 70 (8), 4678-4681 (2002).
- Sanders, M. E., et al. The Streptococcus pneumoniae capsule is required for full virulence in pneumococcal endophthalmitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 865-872 (2011).
- Hunt, J. J., Astley, R., Wheatley, N., Wang, J. T., Callegan, M. C. TLR4 contributes to the host response to Klebsiella intraocular infection. Current Eye Research. 39 (8), 790-802 (2014).
