Iniezione intravitreale e quantificazione dei parametri di infezione in un modello di topo di endoftalmite batterica

Summary

Descriviamo qui un metodo di iniezione intravitreale e la successiva quantificazione batterica nel modello di topo di endoftalmite batterica. Questo protocollo può essere esteso per misurare le risposte immunitarie dell’ospite e l’espressione batterica e genica ospite.

Abstract

Le infezioni batteriche intraoculari sono un pericolo per la vista. I ricercatori utilizzano modelli animali per indagare i fattori ospiti e batterici e le vie di risposta immunitaria associate all’infezione per identificare obiettivi terapeutici praticabili e testare farmaci per prevenire la cecità. La tecnica di iniezione intravitreale viene utilizzata per iniettare organismi, farmaci o altre sostanze direttamente nella cavità vitrea nel segmento posteriore dell’occhio. Qui, abbiamo dimostrato questa tecnica di iniezione per iniziare l’infezione nell’occhio del topo e la tecnica di quantificazione dei batteri intraoculari. Bacillus cereus è stato coltivato in mezzi liquidi per infusione cerebrale per 18 ore e restituito a una concentrazione di 100 unità di formazione di colonie (CFU)/0,5 μL. Un topo C57BL/6J è stato anestetizzato usando una combinazione di chetamina e xiazina. Utilizzando un microiniettore picoliter e aghi capillari in vetro, 0,5 μL della sospensione Bacillus sono stati iniettati nel vitreo medio dell’occhio del topo. L’occhio di controllo contralaterale è stato iniettato con mezzi sterili (controllo chirurgico) o non è stato iniettato (controllo assoluto). A 10 ore dall’infezione, i topi sono stati eutanasiati e gli occhi sono stati raccolti utilizzando pinzette chirurgiche sterili e collocati in un tubo contenente PBS sterile da 400 μL e perline di vetro sterili da 1 mm. Per i test ELISA o mieloperossidasi, l’inibitore della proteinasi è stato aggiunto ai tubi. Per l’estrazione dell’RNA, è stato aggiunto il buffer di lysis appropriato. Gli occhi sono stati omogeneizzati in un omogeneizzatore tissutale per 1-2 minuti. Gli omogeneati sono stati diluiti in serie 10 volte in PBS e traccia diluiti su piastre di agar. Il resto degli omogeneati è stato conservato a -80 °C per ulteriori saggi. Le piastre sono state incubate per 24 ore e la CFU per occhio è stata quantificata. Queste tecniche si traducono in infezioni riproducibili negli occhi del topo e facilitano la quantificazione di batteri vitali, la risposta immunitaria dell’ospite e l’omica dell’espressione genica ospite e batterica.

Introduction

L’endoftalmite batterica è un’infezione devastante che causa infiammazione e, se non trattata correttamente, può causare perdita della vista o cecità. L’endoftalmite deriva dall’ingresso di batteri all’interno dell’occhio^1,2,3,4,5. Una volta negli occhi, i batteri si replicano, producono tossine e altri fattori nocivi e possono causare danni irreversibili a delicate cellule e tessuti retinali. Il danno oculare può anche essere causato dall’infiammazione, a causa dell’attivazione di vie infiammatorie che portano all’afflusso di cellule^{infiammatorie all’interno dell’occhio 1,5,6}. L’endoftalmite può verificarsi a seguito di chirurgia intraoculare (post-operatoria), una lesione penetrante all’occhio (post-traumatica), o dalla diffusione metastatica di batteri nell’occhio da un sito anatomico diverso (endogeno)^7,8,9,10. I trattamenti per l’endoftalmite batterica includono antibiotici, farmaci antinfiammatori o intervento^{chirurgico 3,4,11}. Anche con questi trattamenti, la vista o l’occhio stesso possono essere persi. La prognosi visiva dopo l’endoftalmite batterica varia generalmente a seconda dell’efficacia del trattamento, dell’acuità visiva alla presentazione e della virulenza dell’organismo infettivo.

Bacillus cereus (B. cereus)è uno dei principali agenti patogeni batterici che causa endoftalmite post-traumatica^7,12. La maggior parte dei casi di endoftalmite B. cereus ha un decorso rapido, che può causare cecità in pochi giorni. I tratti distintivi dell’endoftalmite di B. cereus includono infiammazione intraoculare in rapida evoluzione, dolore agli occhi, rapida perdita di acuità visiva e febbre. B. cereus cresce rapidamente nell’occhio rispetto ad altri batteri che comunemente causano infezioni^{oculari 2,4,12} e possiede molti fattori di virulenza. Pertanto, la finestra per un intervento terapeutico riuscito^{è relativamente corta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25}. I trattamenti per questa infezione di solito hanno successo nel trattamento dell’endoftalmite causata da altri agenti patogeni meno virulenti, ma B. cereus endophthalmitis si traduce comunemente in oltre il 70% dei pazienti affetti da una significativa perdita della vista. Circa il 50% di questi pazienti subisce eviscerazione o enucleazione dell’occhio^{infetto 7,16,22,23}. La natura distruttiva e rapida di B. cereus endophthalmitis richiede un trattamento immediato e adeguato. I recenti progressi nel discernere i meccanismi alla base dello sviluppo delle malattie hanno individuato potenziali obiettivi di^{intervento 19,26,27}. I modelli sperimentali di topo di Endoftalmite B. cereus continuano ad essere utili per discernere i meccanismi di infezione e testare potenziali terapie che possono prevenire la perdita della vista.

L’infezione intraoculare sperimentale dei topi con B. cereus è stato un modello strumentale per la comprensione dei fattori batterici e ospiti, nonché delle loro interazioni, durante l’endoftalmite²⁸. Questo modello imita un evento post-traumatico o post-operatorio, in cui i batteri vengono introdotti nell’occhio durante una lesione. Questo modello è altamente riproducibile ed è stato utile per testare terapie sperimentali e fornire dati per miglioramenti nello standard di cura^1,6,19,29,30. Come molti altri modelli di infezione, questo modello consente il controllo indipendente di molti parametri di infezione e consente un esame efficiente e riproducibile dei risultati delle infezioni. Studi su un modello simile nei conigli negli ultimi decenni hanno esaminato gli effetti dei fattori di virulenza di B. cereus nell’occhio^2,4,13,14,31. Iniettando ceppi mutanti B. cereus privi di fattori di virulenza individuali o multipli, il contributo di questi fattori di virulenza alla gravità della malattia può essere misurato da esiti come la concentrazione di batteri in diverse ore di postinfezione o la perdita della funzione^{visiva 13,14,27,31,32}. Inoltre, i fattori host sono stati esaminati in questo modello infettando ceppi di topi knockout privi di specifici fattori infiammatori dell’ospite^{26,29,33,34,35}. Il modello è utile anche per testare potenziali trattamenti per questa malattia iniettando nuovi composti nell’occhio dopo^{l’infezione 30,36}. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo dettagliato che include l’infezione di un occhio di topo con B. cereus,la raccolta dell’occhio dopo l’infezione, la quantificazione della carica batterica intraoculare e la conservazione di campioni per saggiare ulteriori parametri di gravità della malattia.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le raccomandazioni contenute nella Guida alla cura e all’uso degli animali da laboratorio e nella Dichiarazione dell’Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l’uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione. I protocolli sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’University of Oklahoma Health Sciences Center (numeri di protocollo 15-103, 18-043 e 18-087). 1. Aghi di vetro sterili <…

Representative Results

Generare un inoculo riproducibile e l’accuratezza della procedura di iniezione intravitreale sono passaggi chiave nello sviluppo di modelli di endoftalmite microbica. Qui, abbiamo dimostrato la procedura di iniezione intravitreale utilizzando Gram-positive Bacillus cereus. Abbiamo iniettato 100 CFU/0,5 μL di B. cereus nel medio-vitreo di cinque topi C57BL6. Dopo 10 h di postinfezione, abbiamo osservato una crescita intraoculare di B. cereus a circa 1,8 x 105 CFU/occhio. <strong clas…

Discussion

Anche con la disponibilità di potenti antibiotici, farmaci antinfiammatori e chirurgia della vitrectomia, l’endoftalmite batterica può accecare un paziente. Gli studi clinici sono stati utili nello studio dell’endoftalmite; tuttavia, i modelli sperimentali di endoftalmite forniscono risultati rapidi e riproducibili che possono essere tradotti in progressi nello standard di cura, con conseguente migliore risultato visivo per i pazienti.

Il volume vitreo dell’occhio del topo è di circa 7 μL<…

Materials

2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA