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Summary
Abstract
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Protocol
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Immunology and Infection

Intravitreale Injektion und Quantifizierung von Infektionsparametern in einem Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis

Published: February 06, 2021
doi:
10.3791/61749
, , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology,Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine,University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

Wir beschreiben hier eine Methode der intravitrealen Injektion und der anschließenden bakteriellen Quantifizierung im Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um die Immunantworten des Wirts und die bakterielle und die Genexpression zu messen.

Abstract

Intraokulare bakterielle Infektionen sind eine Gefahr für das Sehvermögen. Die Forscher verwenden Tiermodelle, um den Wirt und bakterielle Faktoren und Immunantwortwege im Zusammenhang mit Infektionen zu untersuchen, um lebensfähige therapeutische Ziele zu identifizieren und Medikamente zu testen, um Erblindung zu verhindern. Die intravitreale Injektionstechnik wird verwendet, um Organismen, Medikamente oder andere Substanzen direkt in die Glaskörperhöhle im hinteren Segment des Auges zu injizieren. Hier demonstrierten wir diese Injektionstechnik, um Infektionen im Mausauge und die Technik der Quantifizierung von intraokularen Bakterien zu initiieren. Bacillus cereus wurde 18 Stunden lang in flüssigen Medien des Gehirns angebaut und auf eine Konzentration von 100 Koloniebildenden Einheiten (CFU)/0,5 l resuspendiert. Eine C57BL/6J-Maus wurde mit einer Kombination aus Ketamin und Xylazin anbeet. Mit einem Pikoliter-Mikroinjektor und Glaskapillarnadeln wurde 0,5 l der Bacillus Suspension in den mittleren Glaskörper des Mausauges injiziert. Das kontralaterale Kontrollauge wurde entweder mit sterilen Medien injiziert (chirurgische Kontrolle) oder nicht injiziert (absolute Kontrolle). Nach einer Infektion nach 10 Stunden wurden Mäuse eingeschläfert und die Augen mit einer sterilen chirurgischen Pinzette geerntet und in ein Rohr mit 400 l sterilen PBS und 1 mm sterilen Glasperlen gelegt. Für ELISAs oder Myeloperoxidase-Assays wurde den Röhrchen ein Proteinase-Inhibitor zugesetzt. Für die RNA-Extraktion wurde der entsprechende Lysepuffer hinzugefügt. Die Augen wurden in einem Gewebehomogenisator für 1-2 Minuten homogenisiert. Homogenate wurden in PBS seriell 10-fach verdünnt und auf Agarplatten verdünnt. Der Rest der Homogenate wurde bei -80 °C für zusätzliche Tests gelagert. Die Platten wurden 24 Stunden lang inkubiert und die KBE pro Auge quantifiziert. Diese Techniken führen zu reproduzierbaren Infektionen in den Augen der Maus und erleichtern die Quantifizierung lebensfähiger Bakterien, der Wirtsimmunantwort und der Omics der Wirts- und bakteriellen Genexpression.

Introduction

Bakterielle Endophthalmitis ist eine verheerende Infektion, die Entzündungen verursacht und, wenn sie nicht richtig behandelt wird, zu Verlust des Sehvermögens oder Erblindung führen kann. Endophthalmitis resultiert aus dem Eindringen von Bakterien in das Innere des Auges1,2,3,4,5. Einmal im Auge, Bakterien replizieren, produzieren Toxine und andere schädliche Faktoren, und kann irreversible Schäden an empfindlichen Netzhautzellen und Gewebe verursachen. Augenschäden können auch durch Entzündungen verursacht werden, aufgrund der Aktivierung von entzündungshemmenden Bahnen, die zu einem entzündlichen Zellzufluss in das Innere des Auges führen1,5,6. Endophthalmitis kann nach intraokularer Operation (postoperative), einer durchdringenden Verletzung des Auges (posttraumatische) oder durch metastasierende Ausbreitung von Bakterien in das Auge von einer anderen anatomischen Stelle (endogen)7,8,9,10. Behandlungen für bakterielle Endophthalmitis umfasst Antibiotika, entzündungshemmende Medikamente, oder chirurgische intervention3,4,11. Auch mit diesen Behandlungen kann das Sehvermögen oder das Auge selbst verloren gehen. Die visuelle Prognose nach bakterieller Endophthalmitis variiert in der Regel je nach Wirksamkeit der Behandlung, der Sehschärfe bei der Präsentation und der Virulenz des infizierenden Organismus.

Bacillus cereus (B. cereus) ist einer der wichtigsten bakteriellen Krankheitserreger, die posttraumatische Endophthalmitisverursachen 7,12. Die Mehrheit der Fälle von B. cereus endophthalmitis hat einen schnellen Verlauf, der innerhalb weniger Tage zu Erblindung führen kann. Zu den Merkmalen von B. cereus Endophthalmitis gehören sich schnell entwickelnde intraokulare Entzündungen, Augenschmerzen, schneller Verlust der Sehschärfe und Fieber. B. cereus wächst schnell im Auge im Vergleich zu anderen Bakterien, die häufig Augeninfektionen verursachen2,4,12 und besitzt viele Virulenzfaktoren. Daher ist das Fenster für eine erfolgreiche therapeutische Intervention relativ kurz1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. Behandlungen für diese Infektion sind in der Regel erfolgreich bei der Behandlung von Endophthalmitis durch andere weniger virulente Krankheitserreger verursacht, aber B. cereus Endophthalmitis führt häufig zu mehr als 70% der Patienten leiden an signifikanten Sehverlust. Etwa 50% dieser Patienten unterziehen evisceration oder Enukleation des infiziertenAuges 7,16,22,23. Die zerstörerische und schnelle Natur von B. cereus endophthalmitis erfordert eine sofortige und ordnungsgemäße Behandlung. Die jüngsten Fortschritte bei der Unterscheidung der zugrunde liegenden Mechanismen der Krankheitsentwicklung haben potenzielle Ziele fürInterventionen 19,26,27identifiziert. Experimentelle Mausmodelle von B. cereus Endophthalmitis sind weiterhin nützlich, um die Mechanismen der Infektion zu erkennen und potenzielle Therapeutika zu testen, die Sehverlust verhindern können.

Die experimentelle intraokulare Infektion von Mäusen mit B. cereus war ein instrumentelles Modell für das Verständnis von bakteriellen und Wirtsfaktoren sowie deren Wechselwirkungen während der Endophthalmitis28. Dieses Modell imitiert ein posttraumatisches oder postoperatives Ereignis, bei dem Bakterien während einer Verletzung ins Auge eingeführt werden. Dieses Modell ist sehr reproduzierbar und war nützlich für die Erprobung experimenteller Therapien und die Bereitstellung von Daten für Verbesserungen im Standard der Pflege1,6,19,29,30. Wie viele andere Infektionsmodelle ermöglicht dieses Modell eine unabhängige Kontrolle vieler Infektionsparameter und ermöglicht eine effiziente und reproduzierbare Untersuchung der Infektionsergebnisse. Studien in einem ähnlichen Modell bei Kaninchen in den letzten Jahrzehnten haben die Auswirkungen von B. cereus Virulenzfaktoren im Augeuntersucht 2,4,13,14,31. Durch die Injektion von B. cereus mutierten Stämmen ohne individuelle oder mehrere Virulenzfaktoren kann der Beitrag dieser Virulenzfaktoren zur Schwere der Erkrankung durch Ergebnisse wie die Konzentration von Bakterien zu verschiedenen Stunden der Postinfektion oder den Verlust der Sehfunktion13,14,27,31,32gemessen werden. Darüber hinaus wurden Wirtsfaktoren in diesem Modell untersucht, indem Knockout-Mausstämme ohne spezifische entzündliche Wirtsfaktoren26,29,33,34,35infiziert wurden. Das Modell ist auch nützlich für die Prüfung potenzieller Behandlungen für diese Krankheit durch Injektion neuer Verbindungen in das Auge nach der Infektion30,36. In diesem Manuskript beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das die Infektion eines Mausauges mit B. cereus,die Ernte des Auges nach der Infektion, die Quantifizierung der intraokularen bakteriellen Belastung und die Erhaltung von Proben umfasst, um zusätzliche Parameter der Krankheitsschwere zu untersuchen.

Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Oklahoma Health Sciences Center (Protokollnummern 15-103, 18-043 und 18-087) genehmigt. 1. Sterile Glasnadeln Schalten Sie den Nadel…

Representative Results

Die Erzeugung eines reproduzierbaren Inokulums und die Genauigkeit des intravitrealen Injektionsverfahrens sind wichtige Schritte bei der Entwicklung von Modellen für mikrobielle Endophthalmitis. Hier haben wir das intravitreale Injektionsverfahren mit Gram-positivem Bacillus cereusdemonstriert. Wir injizierten 100 CFU/0,5 l B. cereus in die Mitte von fünf C57BL6-Mäusen. Nach 10 h Nachinfektion beobachteten wir ein intraokulares Wachstum von B. cereus auf ca. 1,8 x 105 KBE/Auge. <…

Discussion

Trotz der Verfügbarkeit von potenten Antibiotika, entzündungshemmenden Medikamenten und Vitrektomie-Chirurgie kann bakterielle Endophthalmitis einen Patienten blenden. Klinische Studien waren nützlich bei der Untersuchung von Endophthalmitis; Experimentelle Modelle der Endophthalmitis liefern jedoch schnelle und reproduzierbare Ergebnisse, die in Fortschritte im Standard der Versorgung übersetzt werden können, was zu einem besseren visuellen Ergebnis für die Patienten führt.

Das Glaskö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Feng Li und Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) für ihre Unterstützung. Unsere Forschung wurde von den Nationalen Gesundheitsinstituten R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 und R01EY024140 unterstützt. Unsere Forschung wurde auch durch P30EY21725 (NIH CORE Grant for Live Animal Imaging and Analysis, Molecular Biology, and Cellular Imaging) unterstützt. Unsere Forschung wurde auch durch das NEI Vision Science Pre-Doctoral Trainee Programm 5T32EY023202, ein Presbyterian Health Foundation Research Support Stipendium und ein uneingeschränktes Stipendium an das Dean A. McGee Eye Institute von Research to Prevent Blindness unterstützt.

Materials

2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA
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Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).
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