Intravitreale injectie en kwantificering van infectieparameters in een muismodel van bacteriële endoftalmitis

Summary

We beschrijven hier een methode van intravitreale injectie en daaropvolgende bacteriële kwantificering in muismodel van bacteriële endoftalmitis. Dit protocol kan worden uitgebreid voor het meten van gastheer immuunresponsen en bacteriële en gastheer genexpressie.

Abstract

Intraoculaire bacteriële infecties vormen een gevaar voor het gezichtsvermogen. Onderzoekers gebruiken diermodellen om de gastheer- en bacteriële factoren en immuunresponstrajecten in verband met infectie te onderzoeken om levensvatbare therapeutische doelen te identificeren en om geneesmiddelen te testen om blindheid te voorkomen. De intravitreale injectietechniek wordt gebruikt om organismen, drugs of andere stoffen rechtstreeks in de glasholte in het achterste segment van het oog te injecteren. Hier hebben we deze injectietechniek aangetoond om infectie in het muizenoog te starten en de techniek van het kwantificeren van intraoculaire bacteriën. Bacillus cereus werd gekweekt in de hersenen hart infusie vloeibare media voor 18 uur en opnieuw geschorst tot een concentratie 100 kolonie vormen eenheden (CFU)/0.5 μL. Een C57BL/6J muis werd verdoofd met behulp van een combinatie van ketamine en xylazine. Met behulp van een picolitermicroinjector en glazen capillaire naalden werd 0,5 μL van de Bacillus-suspensie in het middenglas van het muizenoog geïnjecteerd. De contralaterale controle oog werd ofwel geïnjecteerd met steriele media (chirurgische controle) of werd niet geïnjecteerd (absolute controle). Na 10 uur na infectie werden muizen geëuthanaseerd en werden de ogen geoogst met steriele chirurgische pincet en in een buis geplaatst met 400 μL steriele PBS en 1 mm steriele glazen kralen. Voor ELISA’s of myeloperoxidasetesten werd eiwitaseremmer aan de buizen toegevoegd. Voor RNA-extractie is de juiste lysisbuffer toegevoegd. Ogen werden gehomogeniseerd in een weefsel homogenisator voor 1-2 minuten. Homogenaten werden serieel verdund 10-voudig in PBS en track verdund op agar platen. De rest van de homogenaten werd opgeslagen bij -80 °C voor extra tests. Platen werden 24 uur lang geïncubeerd en CFU per oog werd gekwantificeerd. Deze technieken resulteren in reproduceerbare infecties in de ogen van de muis en vergemakkelijken kwantificering van levensvatbare bacteriën, de gastheer immuunrespons, en omica van gastheer en bacteriële genexpressie.

Introduction

Bacteriële endoftalmitis is een verwoestende infectie die ontstekingen veroorzaakt, en, indien niet goed behandeld, kan resulteren in verlies van gezichtsvermogen of blindheid. Endophthalmitis is het gevolg van de binnenkomst van bacteriën in het binnenste van het oog^1,2,3,4,5. Eenmaal in het oog, bacteriën repliceren, produceren toxines en andere schadelijke factoren, en kan onomkeerbare schade aan delicate netvliescellen en weefsels veroorzaken. Oculaire schade kan ook worden veroorzaakt door ontsteking, als gevolg van de activering van ontstekingstrajecten die leiden tot inflammatoire celinstroom in het binnenste van het oog^1,5,6. Endophthalmitis kan optreden na intraoculaire chirurgie (postoperatieve), een doordringende verwonding aan het oog (posttraumatisch), of van gemetastaserende verspreiding van bacteriën in het oog van een andere anatomische plaats (endogene)^7,8,9,10. Behandelingen voor bacteriële endophthalmitis omvatten antibiotica, ontstekingsremmende geneesmiddelen of chirurgische ingreep^3,4,11. Zelfs met deze behandelingen, visie of het oog zelf kan verloren gaan. De visuele prognose na bacteriële endophthalmitis varieert over het algemeen afhankelijk van de effectiviteit van de behandeling, de gezichtsscherpte bij de presentatie en de virulentie van het infecterende organisme.

Bacillus cereus (B. cereus) is een van de belangrijkste bacteriële pathogenen die posttraumatische endophthalmitis^7,12veroorzaakt . Een meerderheid van B. cereus endophthalmitis gevallen hebben een snelle cursus, die kan resulteren in blindheid binnen een paar dagen. De kenmerken van B. cereus endophthalmitis omvatten snel evoluerende intraoculaire ontsteking, oogpijn, snel verlies van gezichtsscherpte, en koorts. B. cereus groeit snel in het oog in vergelijking met andere bacteriën die vaak ooginfecties veroorzaken^2,4,12 en bezit vele virulentie factoren. Daarom is het venster voor succesvolle therapeutische interventie relatief kort^{1, 2}, ^{3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25}. Behandelingen voor deze infectie zijn meestal succesvol in de behandeling van endophthalmitis veroorzaakt door andere minder virulente ziekteverwekkers, maar B. cereus endoftalmitis resulteert meestal in meer dan 70% van de patiënten die lijden aan aanzienlijk verlies van het gezichtsvermogen. Ongeveer 50% van deze patiënten ondergaan ontdaan of inappucleratie van het geïnfecteerde oog^7,16,22,23. De destructieve en snelle aard van B. cereus endoftalmitis vraagt om onmiddellijke en juiste behandeling. De recente vooruitgang bij het onderscheiden van de onderliggende mechanismen van ziekteontwikkeling heeft potentiële streefcijfers voor interventie^19,26,27vastgesteld . Experimentele muismodellen van B. cereus endophthalmitis blijven nuttig bij het onderscheiden van de mechanismen van infectie en het testen van potentiële therapieën die verlies van het gezichtsvermogen kunnen voorkomen.

Experimentele intraoculaire infectie van muizen met B. cereus is een instrumenteel model voor het begrijpen van bacteriële en gastheer factoren, evenals hun interacties, tijdens endophthalmitis²⁸. Dit model bootst een posttraumatisch of postoperatief voorval na, waarbij bacteriën in het oog worden gebracht tijdens een verwonding. Dit model is zeer reproduceerbaar en is nuttig geweest voor het testen van experimentele therapieën en het verstrekken van gegevens voor verbeteringen in de standaard van de zorg^1,6,19,29,30. Net als veel andere infectie modellen, dit model zorgt voor onafhankelijke controle van vele parameters van infectie en maakt efficiënt en reproduceerbaar onderzoek van infectie resultaten. Studies in een soortgelijk model bij konijnen in de afgelopen decennia hebben de effecten onderzocht van B. cereus virulentiefactoren in het oog^2,4,13,14,31. Door b. cereus mutantstammen te injecteren zonder individuele of meervoudige virulentiefactoren, kan de bijdrage van deze virulentiefactoren aan de ernst van de ziekte worden gemeten aan de gevolgen zoals de concentratie van bacteriën op verschillende uren nainfectie of het verlies van visuele functie^{13,14,27,31,32}. Bovendien zijn in dit model hostfactoren onderzocht door knock-outmuisstammen te infecteren zonder specifieke ontstekingsfactoren^{26,29,33,34,35}. Het model is ook nuttig voor het testen van mogelijke behandelingen voor deze ziekte door het injecteren van nieuwe verbindingen in het oog na infectie^30,36. In dit manuscript beschrijven we een gedetailleerd protocol dat het infecteren van een muizenoog met B. cereusomvat, het oogsten van het oog na infectie, het kwantificeren van intraoculaire bacteriële belasting en het bewaren van specimens om extra parameters van de ernst van de ziekte te testen.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd naar aanleiding van de aanbevelingen in de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en de Association for Research in Vision and Ofhthalmology Statement for the Use of Animals in Oogheelkundig en Vision Research. De protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center (protocolnummers 15-103, 18-043 en 18-087). 1. Steriele glazen naalden Zet de naaldpipettre…

Representative Results

Het genereren van een reproduceerbaar entmateriaal en nauwkeurigheid van de intravitreale injectieprocedure zijn belangrijke stappen in het ontwikkelen van modellen van microbiële endoftalmitis. Hier hebben we aangetoond dat de intravitreal injectie procedure met behulp van Gram-positieve Bacillus cereus. We injecteerden 100 CFU/0,5 μL B. cereus in het middenglas van vijf C57BL6 muizen. Na 10 uur nainfectie zagen we intraoculaire groei van B. cereus tot ongeveer 1,8 x 105 CFU/oog. …

Discussion

Zelfs met de beschikbaarheid van krachtige antibiotica, ontstekingsremmende geneesmiddelen en vitrectomiechirurgie, bacteriële endophthalmitis kan een patiënt blind maken. Klinische studies zijn nuttig geweest bij het bestuderen van endophthalmitis; echter, experimentele modellen van endoftalmitis bieden snelle en reproduceerbare resultaten die kunnen worden vertaald naar vooruitgang in de standaard van de zorg, wat resulteert in een betere visuele uitkomst voor patiënten.

Het glasvochtvolu…

Materials

2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA