Injection intravitreal et quantitation des paramètres d’infection dans un modèle de souris de l’endophtalmite bactérienne

Summary

Nous décrivons ici une méthode d’injection intravitreal et de quantitation bactérienne suivante dans le modèle de souris de l’endophtalmitis bactérien. Ce protocole peut être étendu pour mesurer les réponses immunitaires de l’hôte et l’expression bactérienne et du gène hôte.

Abstract

Les infections bactériennes intraoculaires sont un danger pour la vision. Les chercheurs utilisent des modèles animaux pour étudier les facteurs hôtes et bactériens et les voies de réponse immunitaire associées à l’infection afin d’identifier des cibles thérapeutiques viables et de tester des médicaments pour prévenir la cécité. La technique d’injection intravitreal est employée pour injecter des organismes, des drogues, ou d’autres substances directement dans la cavité vitreuse dans le segment postérieur de l’oeil. Ici, nous avons démontré cette technique d’injection pour initier l’infection dans l’œil de la souris et la technique de quantification des bactéries intraoculaires. Bacillus cereus a été cultivé dans les médias liquides d’infusion de coeur de cerveau pendant 18 heures et résuspendait à une concentration 100 unités de formation de colonie (CFU)/0.5 μL. Une souris C57BL/6J a été anesthésiée à l’aide d’une combinaison de kétamine et de xylazine. À l’aide d’un microinjecteur picolitre et d’aiguilles capillaires en verre, 0,5 μL de la suspension Bacillus a été injecté dans le milieu vitreux de l’œil de la souris. L’oeil contralatéral de commande a été injecté avec le médias stérile (contrôle chirurgical) ou n’a pas été injecté (contrôle absolu). À 10 heures après l’infection, les souris ont été euthanasiées, et les yeux ont été récoltés à l’aide de pinces chirurgicales stériles et placés dans un tube contenant 400 μL de PBS stérile et 1 mm de perles de verre stériles. Pour les ELISAs ou myeloperoxidase assays, inhibiteur de la proteinase a été ajouté aux tubes. Pour l’extraction de l’ARN, le tampon de lyse approprié a été ajouté. Les yeux ont été homogénéisés dans un homogénéiseur de tissu pendant 1-2 minutes. Les homogénéisations ont été diluées en série 10 fois dans pbs et la voie diluée sur des plaques d’agar. Le reste des homogénées ont été stockés à -80 °C pour des analyses supplémentaires. Les plaques ont été incubées pendant 24 heures et cfu par oeil a été quantifié. Ces techniques entraînent des infections reproductibles dans les yeux des souris et facilitent la quantitation des bactéries viables, la réponse immunitaire de l’hôte et l’omique de l’expression des gènes de l’hôte et des bactéries.

Introduction

L’endophtalmite bactérienne est une infection dévastatrice qui provoque une inflammation et, si elle n’est pas traitée correctement, peut entraîner une perte de vision ou de cécité. L’endophtalmite résulte de l’entrée de bactéries dans l’intérieur^{de l’œil 1,2,3,4,5}. Une fois dans l’œil, les bactéries se répliquent, produisent des toxines et d’autres facteurs nocifs, et peuvent causer des dommages irréversibles aux cellules et tissus rétiniens délicats. Les dommages oculaires peuvent également être provoqués par l’inflammation, due à l’activation des voies inflammatoires menant à l’afflux inflammatoire de cellules dans^{l’intérieur de l’oeil 1,5,6.} L’endophtalmite peut survenir à la suite d’une chirurgie intraoculaire (postopératoire), d’une lésion pénétrante de l’œil (post-traumatique) ou d’une propagation métastatique de bactéries dans l’œil à partir d’un autre site anatomique (endogène)^7,8,9,10. Les traitements de l’endophtalmite bactérienne comprennent des antibiotiques, des anti-inflammatoires ou une intervention^{chirurgicale 3,4,11}. Même avec ces traitements, la vision ou l’œil lui-même peut être perdu. Le pronostic visuel après endophtalmite bactérienne varie généralement selon l’efficacité du traitement, l’acuité visuelle à la présentation, et la virulence de l’organisme infectieux.

Bacillus cereus (B. cereus) est l’un des principaux pathogènes bactériens qui provoque l’endophtalmite post-traumatique^7,12. La majorité des cas d’endophtalmite de B. cereus ont un cours rapide, qui peut avoir comme conséquence la cécité en quelques jours. Les caractéristiques de l’endophtalmite de B. cereus incluent l’inflammation intraoculaire en évolution rapide, la douleur oculaire, la perte rapide de l’acuité visuelle, et la fièvre. B. cereus se développe rapidement dans l’œil par rapport à d’autres bactéries qui causent généralement des infections^{oculaires 2,4,12} et possède de nombreux facteurs de virulence. Par conséquent, la fenêtre pour une intervention thérapeutique réussie est^{relativement courte 1, 2}, ^{3 , 4}, ^{5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25}. Les traitements pour cette infection réussissent habituellement à traiter l’endophtalmite provoquée par d’autres agents pathogènes moins virulents, mais b. cereus endophthalmitis a généralement comme résultat plus de 70% de patients souffrant de la perte significative de vision. Environ 50% de ces patients subissent l’éviscération ou l’enucleation de^{l’oeil infecté 7,16,22,23}. La nature destructrice et rapide de l’endophtalmite de B. cereus exige un traitement immédiat et approprié. Des progrès récents dans le discernement des mécanismes sous-jacents du développement de la maladie ont identifié des cibles^{potentielles pour l’intervention 19,26,27}. Les modèles expérimentaux de souris de b. cereus endophthalmitis continuent d’être utiles en discernant les mécanismes de l’infection et en testant les thérapeutiques potentielles qui peuvent empêcher la perte de vision.

L’infection intraoculaire expérimentale des souris avec B. cereus a été un modèle instrumental pour comprendre des facteurs bactériens et d’hôte, aussi bien que leurs interactions, pendant l’endophthalmitis^28. Ce modèle imite un événement post-traumatique ou postopératoire, dans lequel des bactéries sont introduites dans l’œil lors d’une blessure. Ce modèle est hautement reproductible et a été utile pour tester des thérapies expérimentales et fournir des données pour l’amélioration de la norme^{de soins 1,6,19,29,30}. Comme beaucoup d’autres modèles d’infection, ce modèle permet un contrôle indépendant de nombreux paramètres de l’infection et permet un examen efficace et reproductible des résultats de l’infection. Des études menées dans un modèle similaire chez les lapins au cours des dernières décennies ont examiné les effets des facteurs de virulence B. cereus dans^{l’œil 2,4,13,14,31}. En injectant des souches mutantes B. cereus dépourvues de facteurs de virulence individuels ou multiples, la contribution de ces facteurs de virulence à la gravité de la maladie peut être mesurée par des résultats tels que la concentration de bactéries à différentes heures de postinfection ou la perte de fonction^{visuelle 13,14,27,31,32}. En outre, des facteurs d’hôte ont été examinés dans ce modèle en infectant des souches de souris de KO manquant des facteurs inflammatoires spécifiques^{d’hôte 26,29,33,34,35.} Le modèle est également utile pour tester les traitements potentiels pour cette maladie en injectant de nouveaux composés dans l’œil après l’infection^30,36. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole détaillé qui inclut infecter un oeil de souris avec B. cereus,récolter l’oeil après infection, quantifier la charge bactérienne intraoculaire, et préserver des spécimens pour évaluer des paramètres additionnels de la sévérité de la maladie.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées à la suite des recommandations du Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma (numéros de protocole 15-103, 18-043 et 18-087). 1. Aiguilles …

Representative Results

La génération d’un inoculum reproductible et l’exactitude de la procédure d’injection intravitreal sont des étapes clés dans le développement de modèles d’endophtalmite microbienne. Ici, nous avons démontré la procédure d’injection intravitreal utilisant Gram-positive Bacillus cereus. Nous avons injecté 100 CFU/0,5 μL de B. cereus dans le milieu vitreux de cinq souris C57BL6. Après 10 h postinfection, nous avons observé la croissance intraoculaire de B. cereus à approxi…

Discussion

Même avec la disponibilité d’antibiotiques puissants, de médicaments anti-inflammatoires et de chirurgie vitrectomie, l’endophtalmite bactérienne peut aveugler un patient. Les études cliniques ont été utiles dans l’étude de l’endophtalmite; cependant, les modèles expérimentaux de l’endophtalmite fournissent des résultats rapides et reproductibles qui peuvent être traduits au progrès dans la norme de soin, ayant pour résultat de meilleurs résultats visuels pour des patients.

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Materials

2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA