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Summary
Abstract
Introduction
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Immunology and Infection

細菌性内眼炎マウスモデルにおけるウイルス感染の注入と感染量の定量

Published: February 06, 2021
doi:
10.3791/61749
, , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology,University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology,Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine,University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

ここでは細菌性内膜炎のマウスモデルにおけるビトリアル内注射とその後の細菌定量の方法について説明する。このプロトコルは、宿主の免疫応答および細菌および宿主遺伝子発現を測定するために拡張することができる。

Abstract

眼内細菌感染は視力にとって危険である。研究者は、動物モデルを使用して、感染に関連する宿主および細菌因子および免疫応答経路を調査し、実行可能な治療標的を同定し、失明を予防するための薬物を検査する。細胞内注射技術は、眼の後部の膜腔に生物、薬物、または他の物質を直接注入するために使用される。ここでは、マウス眼での感染を開始するこの注射技術と眼内細菌を定量する技術を実証した。 セレウス菌 は脳心注入液培地中で18時間成長し、100コロニー形成ユニット(CFU)/0.5μLの濃度に再懸濁した。ケタミンとキシラジンを併用してC57BL/6Jマウスを麻酔した。ピコリットルマイクロインジェクターとガラス毛細血管針を用いて、0.5μLの バチルス 懸濁液をマウス眼の中硝子に注入した。対照眼は滅菌培地を注射したか(外科的制御)、注入されなかった(絶対対照)。感染後10時間で、マウスを安楽死させ、無菌手術用ピンセットを使用して目を採取し、400μLの無菌PBSおよび1mmの無菌ガラスビーズを含むチューブに入れた。ELISAまたは骨髄ペルオキシダーゼアッセイの場合、プロテイナーゼ阻害剤をチューブに添加した。RNA抽出のために、適当なリシスバッファーを添加した。目を組織ホモジナイザーで1〜2分間ホモジナイザー化した。ホモジェナートをPBSで10倍に連続して希釈し、寒天プレートにトラック希釈した。ホモジエートの残りの部分は、追加のアッセイのために-80°Cで保存した。プレートを24時間インキュベートし、1眼当たりのCFUを定量化した。これらの技術は、マウスの目に再現性の感染症をもたらし、生存可能な細菌、宿主の免疫応答、および宿主および細菌遺伝子発現のオミックスの定量を促進する。

Introduction

細菌性心内炎は炎症を引き起こす壊滅的な感染症であり、適切に治療しないと視力や失明を引き起こす可能性があります。眼内炎は、目1、2、3、4、5の内部に細菌が入り込んだ結果である。一度目に入ると、細菌は複製し、毒素やその他の有害因子を産生し、繊細な眼下の細胞および組織に不可逆的な損傷を引き起こす可能性がある。眼の損傷は、炎症によっても引き起こされ得るが、眼の内部に炎症細胞が流入する炎症経路の活性化に起因する1、5、6。子宮内膜炎は、眼内手術(術後)、眼への貫通傷害(心的外傷後)、または異なる解剖学的部位(内因性)7、8、9、10から眼への細菌の転移性の広がりから起こり得る。細菌性眼内炎の治療には、抗生物質、抗炎症薬、または外科的介入3、4、11が含まれる。これらの治療を受けても、視力や目自体が失われる可能性があります。細菌性心内炎後の視覚予後は、一般に、治療効果、提示時の視力、および感染性生物の毒性によって異なる。

セレウス菌(B.セレウス)は、心的外傷後心内膜炎7、12を引き起こす主要な細菌病原体の1つである。B.セレウス心内炎の症例の大半は急速な経過を有し、数日以内に失明を引き起こす可能性がある。B.セレウス心内炎の特徴は、急速に進化する眼内炎症、眼痛、視力の急速な喪失、発熱を含む。B. セレウスは、一般的に眼感染症2、4、12を引き起こす他の細菌と比較して目に急速に成長し、多くの病原性因子を有する。したがって、治療介入を成功させるためのウィンドウは、1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25である。 この感染症の治療は、通常、他の毒性の低い病原体によって引き起こされる心内炎の治療に成功するが、B.セレウス心内膜炎は一般的に有意な視力低下に苦しむ患者の70%以上をもたらす。これらの患者の約50%は、感染した眼の摘出または摘出を受ける7、16、22、23である。B.セレウス眼内炎の破壊的かつ迅速な性質は、即時かつ適切な治療を必要とする。最近、疾患開発の基礎的なメカニズムを見極める上での進歩は、介入のための潜在的な標的を特定した19,26,27.B.セレウス眼内炎の実験的マウスモデルは、感染のメカニズムを識別し、視力低下を防ぐ可能性のある潜在的な治療法をテストするのに引き続き有用である。

B.セレウスを有するマウスの実験的眼内感染は、子宮内膜炎28の間に細菌および宿主因子、ならびにそれらの相互作用を理解するためのインストゥルメンタルモデルであった。このモデルは、外傷後または術後の事象を模倣し、怪我の間に細菌が目に導入される。このモデルは非常に再現性が高く、試験的療法のテストや、ケアの標準の改善のためのデータを提供するのに有用であった1、6、 19、29、30。他の多くの感染モデルと同様に、このモデルは感染の多くのパラメータの独立した制御を可能にし、感染結果の効率的で再現可能な検査を可能にする。過去数十年にわたるウサギの同様のモデルの研究は、目2、4、13、14、31におけるB.セレウス毒性因子の影響を調べた。個々または複数の病原性因子を欠く変異株B.セレウスを注入することにより、これらの病原性因子の疾患重症度への寄与は、異なる時間の感染時における細菌の濃度または視覚機能13、14、27、31、32の喪失などの結果によって測定することができる。さらに、特定の炎症性宿主因子26、29、33、34、35を欠くノックアウトマウス株に感染することにより、このモデルでホスト因子が検討されている。このモデルは、感染後に目に新しい化合物を注入することによって、この疾患の潜在的な治療法をテストするのにも有用である30,36.本稿では、B.セレウスにマウスの眼を感染させること、感染後の眼を収穫すること、眼内細菌負荷を定量化すること、および疾患の重症度の追加パラメータをアッセイするために標本を保存することを含む詳細なプロトコルを記述する。

Protocol

すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドと眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究協会の勧告に従って行われました。このプロトコルは、オクラホマ大学保健科学センターの施設動物管理および使用委員会(プロトコル番号15-103、18-043、および18-087)によって承認されました。 1. 滅菌ガラス針 針ピペットの引き手を <stron…

Representative Results

再現性の接種およびビトウィーン内注入手順の精度を生成することは、微生物内眼炎のモデルを開発する上で重要なステップです。ここでは、グラム陽性 バチルスセレウスを用いたビトリア内注入手順を実証した。5匹のC57BL6マウスの中部に100CFU/0.5μLの B.セレウス を注入した。10時間の後の感染後、我々はおよそ1.8 x 10 5 CFU/眼に B.セレウス の眼内成長を 観察した…

Discussion

強力な抗生物質、抗炎症薬、および虚内切開手術が可能であっても、細菌性子宮内膜炎は患者を盲目にすることができます。臨床研究は、眼内炎の研究に有用であった;しかし、眼科医炎の実験モデルは、迅速かつ再現性の高い結果を提供し、治療水準の進歩に変換することができ、患者の視覚結果を向上させます。

マウスアイの膜状ボリュームは約7μL40</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、フェン・リー博士とマーク・ディットマー博士(OUHSC P30ライブアニマルイメージングコア、ディーンA.マギーアイ研究所、オクラホマシティ、OK、米国)の支援に感謝します。私たちの研究は、国立衛生研究所の助成金R01EY028810、R01EY028066、R01EY025947、およびR01EY024140によってサポートされています。また、P30EY21725(生きた動物イメージングと分析、分子生物学、細胞イメージングのためのNIH CORE助成金)によっても研究が支援されています。私たちの研究はまた、NEIビジョンサイエンス博士後期研修プログラム5T32EY023202、長老派健康財団研究支援助成金、および失明防止研究からディーンA.マギーアイ研究所への無制限の助成金によってサポートされています。

Materials

2-20 µL pipette RANIN L0696003G NA
37oC Incubator Fisher Scientific 11-690-625D NA
Bacto Brain Heart Infusion BD 90003-032 NA
Cell Microinjector MicroData Instrument, Inc. PM2000 NA
Fine tip forceps Thermo Fisher Scientific 12-000-122 NA
Glass beads 1.0 mm BioSpec 11079110 NA
Incubator Shaker New Brunswick Scientific NB-I2400 NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters Kimble 71900-5 NA
Micro-Pipette Beveler Sutter Instrument Co. BV-10 NA
Microscope Axiostar Plus Zeiss NA
Microscope OPMI Lumera Zeiss NA
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 NA
Multichannel pipette 30-300 µL Biohit 15626090 NA
Multichannel pipette 5-100 µL Biohit 9143724 NA
Needle/Pipette Puller Kopf 730 NA
PBS GIBCO 1897315 Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693159001 Molecular grade
Reverse action forceps Katena K5-8228 NA
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Mursalin, M. H., Livingston, E., Coburn, P. S., Miller, F. C., Astley, R., Callegan, M. C. Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis. J. Vis. Exp. (168), e61749, doi:10.3791/61749 (2021).
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