Intravitreal injektion og kvantisering af infektionsparametre i en musemodel af bakteriel endophthalmitis

Summary

Vi beskriver her en metode til intravitreal injektion og efterfølgende bakteriel kvælning i musemodel af bakteriel endophthalmitis. Denne protokol kan udvides til måling af værtens immunrespons og bakterielle og værtsgenetielle udtryk.

Abstract

Intraokulære bakterielle infektioner er en fare for synet. Forskere bruger dyremodeller til at undersøge værten og bakterielle faktorer og immunrespons veje forbundet med infektion til at identificere levedygtige terapeutiske mål og til at teste lægemidler til at forebygge blindhed. Den intravitreal injektion teknik bruges til at injicere organismer, narkotika, eller andre stoffer direkte ind i glaslegemen i den bageste del af øjet. Her demonstrerede vi denne injektionsteknik for at starte infektion i museøjet og teknikken med kvantificering af intraokulære bakterier. Bacillus cereus blev dyrket i hjernens hjerteinfusion flydende medier i 18 timer og resuspenderet til en koncentration 100 kolonidannende enheder (CFU)/0,5 μL. En C57BL/6J mus blev bedøvet ved hjælp af en kombination af ketamin og xylazin. Ved hjælp af en picoliter mikroinjektor og glas kapillær nåle, 0,5 μL af Bacillus suspension blev injiceret i midten glaslegeme af museøjet. Det kontralaterale kontroløje blev enten injiceret med sterile medier (kirurgisk kontrol) eller blev ikke injiceret (absolut kontrol). Efter 10 timer efter infektion blev mus aflivet, og øjnene blev høstet ved hjælp af sterile kirurgiske pincet og placeret i et rør, der indeholder 400 μL steril PBS og 1 mm sterile glasperler. For ELISAs eller myeloperoxidase assays, proteinase hæmmer blev tilsat til rørene. Til RNA-ekstraktion blev den relevante lysisbuffer tilsat. Øjnene blev homogeniseret i en vævshomogenisator i 1-2 minutter. Homogenater blev seriefortyndet 10 gange i PBS og spor fortyndet på agar plader. Resten af homogenaterne blev opbevaret ved -80 °C for yderligere analyser. Pladerne blev inkuberet i 24 timer, og CFU pr. øje blev kvantificeret. Disse teknikker resulterer i reproducerbare infektioner i museøjne og lette kvantiteten af levedygtige bakterier, værten immunrespons, og omics af vært og bakteriel genekspression.

Introduction

Bakteriel endophthalmitis er en ødelæggende infektion, der forårsager betændelse, og, hvis de ikke behandles ordentligt, kan resultere i tab af syn eller blindhed. Endophthalmitis skyldes, at bakterierne kommer ind i det indre af øjet^1,2,3,4,5. Når i øjet, bakterier replikere, producere toksiner og andre skadelige faktorer, og kan forårsage uoprettelige skader på sarte retinale celler og væv. Øjenskader kan også være forårsaget af betændelse, på grund af aktivering af inflammatoriske veje, der fører til inflammatoriskcelletilstrømning i det indre^aføjet^1,5,6. Endophthalmitis kan forekomme efter intraokulært kirurgi (postoperativ), en gennemtrængende skade på øjet (posttraumatisk), eller fra metastatisk spredning af bakterier i øjet fra et andet anatomisk sted (endogen)^7,8,9,10. Behandlinger for bakteriel endophthalmitis omfatter antibiotika, anti-inflammatoriske lægemidler, eller kirurgisk indgreb^3,4,11. Selv med disse behandlinger, vision eller øjet selv kan gå tabt. Den visuelle prognose efter bakteriel endophthalmitis varierer generelt afhængigt af behandlingseffektiviteten, den visuelle skarphed ved præsentationen og den inficerende organismes virulens.

Bacillus cereus (B. cereus) er en af de vigtigste bakterielle patogener, der forårsager post-traumatisk endophthalmitis^7,12. Et flertal af B. cereus endophthalmitis tilfælde har en hurtig kurs, hvilket kan resultere i blindhed inden for et par dage. Kendetegnende for B. cereus endophthalmitis omfatter hurtigt udvikler intraokulært inflammation, øjensmerter, hurtigt tab af synsstyrke, og feber. B. cereus vokser hurtigt i øjet i forhold til andre^bakterier,som almindeligvis forårsager øjeninfektioner²,^4,12 og besidder mange virulensfaktorer. Derfor er vinduet for vellykket terapeutisk intervention^{relativt kort 1, 2, 3, 4, 5, 6,} 7^{, 11}, ^{12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25}. Behandlinger for denne infektion er normalt en succes i behandling af endophthalmitis forårsaget af andre mindre virulente patogener, men B. cereus endophthalmitis almindeligvis resulterer i større end 70% af patienter, der lider af betydelige synstab. Omkring 50% af disse patienter gennemgår udtagning eller enucleation af det inficerede øje^7,16,22,23. Den destruktive og hurtige karakter af B. cereus endophthalmitis kræver øjeblikkelig og korrekt behandling. De seneste fremskridt med hensyn til at skelne de underliggende mekanismer for sygdomsudvikling har identificeret potentielle mål for intervention^19,26,27. Eksperimentelle musemodeller af B. cereus endophthalmitis fortsat være nyttige i at skelne mekanismerne for infektion og test potentielle terapeutiske, der kan forhindre synstab.

Eksperimentel intraokulært infektion af mus med B. cereus har været en instrumental model for forståelse af bakterielle og værtsfaktorer, samt deres interaktioner, under endophthalmitis²⁸. Denne model efterligner en post-traumatisk eller post-operative begivenhed, hvor bakterier indføres i øjet under en skade. Denne model er meget reproducerbar og har været nyttig til afprøvning af eksperimentelle behandlingsformer og tilvejebringelse af data til forbedringer i standarden for pleje^1,6,19,29,30. Ligesom mange andre infektion modeller, denne model giver mulighed for uafhængig kontrol af mange parametre for infektion og muliggør en effektiv og reproducerbar undersøgelse af infektion resultater. Undersøgelser i en lignende model hos kaniner i de seneste årtier har undersøgt virkningerne af B. cereus virulensfaktorer i^{øjet 2,4,13,14,31}. Ved at indsprøjte B. cereus mutant stammer mangler individuelle eller flere virlensfaktorer, kan bidraget af disse virulensfaktorer til sygdommens sværhedsgrad måles ved resultater såsom koncentration af bakterier ved forskellige tidspunkter efter infektion eller tab af visuel funktion^{13,14,27,31,32}. Desuden er værtsfaktorer blevet undersøgt i denne model ved at inficere knockout musestammer, der mangler specifikke inflammatoriske værtsfaktorer^{26,29,33,34,35}. Modellen er også nyttig til at teste potentielle behandlinger for denne sygdom ved at indsprøjte nye forbindelser i øjet efter infektion^30,36. I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol, som omfatter at inficere et museøje med B. cereus,høste øjet efter infektion, kvantificere intraokulært bakteriebelastning og bevare prøver for at analysere yderligere parametre for sygdommens sværhedsgrad.

Protocol

Alle procedurer blev udført efter anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr og Association for Research in Vision og Oftalmology Statement for the Use of Animals in Oftalmmic and Vision Research. Protokollerne blev godkendt af Den Institutionelle Animal Care and Use Committee ved University of Oklahoma Health Sciences Center (protokol numre 15-103, 18-043, og 18-087). 1. Sterile glasnåle Tænd for nålepipettetrækeren. Juster <str…

Representative Results

Generering af en reproducerbar inokulum og nøjagtigheden af den intravitreale injektion procedure er vigtige trin i udviklingen af modeller af mikrobiel endophthalmitis. Her viste vi den intravitreale injektionsprocedure ved hjælp af Gram-positiv Bacillus cereus. Vi injicerede 100 CFU/0,5 μL B. cereus i midten af glaslege udglasset med fem C57BL6-mus. Efter 10 timer efter infektion observerede vi intraokulært vækst af B. cereus til ca. 1,8 x 105 CFU/eye. Fig…

Discussion

Selv med tilgængeligheden af potente antibiotika, anti-inflammatoriske lægemidler, og vitektomi kirurgi, bakteriel endophthalmitis kan blinde en patient. Kliniske undersøgelser har været nyttige i at studere endophthalmitis; imidlertid giver eksperimentelle modeller af endophthalmitis hurtige og reproducerbare resultater, der kan oversættes til fremskridt inden for behandlingsstandard, hvilket resulterer i bedre visuelt resultat for patienterne.

Museøjets glasagtige volumen er ca. 7 μL<…

Materials

2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA