Intravitreal injeksjon og mengde infeksjon parametere i en musemodell av bakteriell endoftalmitt

Summary

Vi beskriver her en metode for intravitreal injeksjon og påfølgende bakteriell kvantitet i musemodell av bakteriell endoftalmitt. Denne protokollen kan utvides for måling av vertens immunresponser og bakterielle og vertsgenuttrykk.

Abstract

Intraokulære bakterielle infeksjoner er en fare for synet. Forskere bruker dyremodeller for å undersøke verten og bakterielle faktorer og immunresponsveier forbundet med infeksjon for å identifisere levedyktige terapeutiske mål og for å teste legemidler for å forhindre blindhet. Den intravitreale injeksjonsteknikken brukes til å injisere organismer, legemidler eller andre stoffer direkte inn i glasslegemet i det bakre segmentet av øyet. Her demonstrerte vi denne injeksjonsteknikken for å initiere infeksjon i museøyet og teknikken for å kvantifisere intraokulære bakterier. Bacillus cereus ble dyrket i hjernen hjerte infusjon flytende media i 18 timer og resuspended til en konsentrasjon 100 koloni forming enheter (CFU) / 0,5 μL. En C57BL/6J-mus ble bedøvet ved hjelp av en kombinasjon av ketamin og xylazin. Ved hjelp av en picoliter mikroinjektor og glasskapillære nåler, ble 0,5 μL av Bacillus suspensjon injisert i midten glasslegemet av museøyet. Det kontralaterale kontrolløyet ble enten injisert med sterilt medium (kirurgisk kontroll) eller ble ikke injisert (absolutt kontroll). Ved 10 timer etter infeksjon ble mus eutanisert, og øynene ble høstet ved hjelp av sterile kirurgiske pinsett og plassert i et rør som inneholder 400 μL sterile PBS og 1 mm sterile glassperler. For ELISAs eller myeloperoxidaseanalyser ble proteinasehemmer tilsatt i rørene. For RNA-ekstraksjon ble den aktuelle lysisbufferen lagt til. Øynene ble homogenisert i en vev homogenisator i 1-2 minutter. Homogenater ble serielt fortynnet 10 ganger i PBS og spor fortynnet på agarplater. Resten av homogenatene ble lagret ved -80 °C for ytterligere analyser. Platene ble inkubert i 24 timer og CFU per øye ble kvantifisert. Disse teknikkene resulterer i reproduserbare infeksjoner i museøynene og letter kvantitet av levedyktige bakterier, vertens immunrespons og omics av vert og bakteriell genuttrykk.

Introduction

Bakteriell endoftalmitt er en ødeleggende infeksjon som forårsaker betennelse, og hvis den ikke behandles riktig, kan det føre til tap av syn eller blindhet. Endoftalmitt skyldes inntreden av bakterier i det indre av øyet^1,2,3,4,5. En gang i øyet, bakterier replikere, produsere giftstoffer og andre skadelige faktorer, og kan forårsake irreversible skader på delikate retinale celler og vev. Okulær skade kan også skyldes betennelse, på grunn av aktivering av inflammatoriske veier som fører til inflammatorisk celletilstrømning til det indre av øyet^1,5,6. Endoftalmitt kan oppstå etter intraokulær kirurgi (postoperativ), en gjennomtrengende skade på øyet (posttraumatisk), eller fra metastatisk spredning av bakterier inn i øyet fra et annet anatomisk sted (endogene)^7,8,9,10. Behandlinger for bakteriell endoftalmitt inkluderer antibiotika, antiinflammatoriske legemidler eller kirurgisk inngrep^3,4,11. Selv med disse behandlingene kan synet eller øyet i seg selv gå tapt. Den visuelle prognosen etter bakteriell endoftalmitt varierer vanligvis avhengig av behandlingseffektiviteten, synsskarpheten ved presentasjon og virulens av den smittende organismen.

Bacillus cereus (B. cereus) er en av de store bakterielle patogener som forårsaker posttraumatisk endoftalmitt^7,12. Et flertall av B. cereus endoftalmitt tilfeller har en rask kurs, noe som kan resultere i blindhet innen få dager. Kjennetegnene på B. cereus endoftalmitt inkluderer raskt utviklende intraokulær betennelse, øyesmerter, raskt tap av synsskarphet og feber. B. cereus vokser raskt i øyet sammenlignet med andre bakterier som vanligvis forårsaker^{øyeinfeksjoner 2,4,12} og har mange virulensfaktorer. Derfor er vinduet for vellykket terapeutisk intervensjon relativt kort^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25}. Behandlinger for denne infeksjonen er vanligvis vellykket i behandling av endoftalmitt forårsaket av andre mindre virulent patogener, men B. cereus endoftalmitt resulterer vanligvis i større enn 70% av pasientene som lider av betydelig synstap. Omtrent 50% av disse pasientene gjennomgår evisceration eller enucleation av det infiserte^{øyet 7,16,22,23}. Den destruktive og raske naturen til B. cereus endoftalmitt krever umiddelbar og riktig behandling. Nylig fremgang i å skjelne de underliggende mekanismene for sykdomsutvikling har identifisert potensielle mål for intervensjon^19,26,27. Eksperimentelle musemodeller av B. cereus endoftalmitt fortsetter å være nyttige for å skjelne mekanismene for infeksjon og teste potensielle terapeutiske midler som kan forhindre synstap.

Eksperimentell intraokulær infeksjon av mus med B. cereus har vært en instrumentell modell for å forstå bakterielle og vertsfaktorer, samt deres interaksjoner, under endoftalmitt²⁸. Denne modellen etterligner en posttraumatisk eller postoperativ hendelse, der bakterier blir introdusert i øyet under en skade. Denne modellen er svært reproduserbar og har vært nyttig for testing av eksperimentelle terapier og gi data for forbedringer i standard for^{omsorg 1,6,19,29,30}. Som mange andre infeksjonsmodeller gir denne modellen mulighet for uavhengig kontroll av mange infeksjonsparametere og muliggjør effektiv og reproduserbar undersøkelse av infeksjonsutfall. Studier i en lignende modell hos kaniner de siste tiårene har undersøkt effekten av B. cereus virulens faktorer i øyet^2,4,13,14,31. Ved å injisere B. cereus muterte stammer som mangler individuelle eller flere virulensfaktorer, kan bidraget fra disse virulensfaktorene til sykdomsalvorlighetsgrad måles ved utfall som konsentrasjon av bakterier på forskjellige timer etter infection eller tap av visuell^{funksjon 13,14,27,31,32}. I tillegg har vertsfaktorer blitt undersøkt i denne modellen ved å infisere knockout-musstammer som mangler spesifikke inflammatoriske^{vertsfaktorer 26,29,33,34,35}. Modellen er også nyttig for å teste potensielle behandlinger for denne sykdommen ved å injisere nye forbindelser i øyet etter infeksjon^30,36. I dette manuskriptet beskriver vi en detaljert protokoll som inkluderer å infisere et museøye med B. cereus, høste øyet etter infeksjon, kvantifisere intraokulær bakteriell belastning og bevare prøver for å analysere ytterligere parametere for sykdomsalvorlighetsgrad.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført etter anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr og Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Oklahoma Health Sciences Center (protokollnummer 15-103, 18-043 og 18-087). 1. Sterile glassnåler Slå på nålepipettetrekkeren. Juster …

Representative Results

Generering av reproduserbar inokul og nøyaktighet av intravitreal injeksjonsprosedyren er viktige trinn i utviklingen av modeller av mikrobiell endoftalmitt. Her demonstrerte vi den intravitreale injeksjonsprosedyren ved hjelp av Gram-positive Bacillus cereus. Vi injiserte 100 CFU/0,5 μL B. cereus i midten av glasslegemet på fem C57BL6-mus. Etter 10 timer etterinfeksjon observerte vi intraokulær vekst av B. cereus til ca. 1,8 x 105 CFU/øye. Figur 1 …

Discussion

Selv med tilgjengeligheten av potente antibiotika, antiinflammatoriske legemidler og vitrektomikirurgi, kan bakteriell endoftalmitt blinde en pasient. Kliniske studier har vært nyttige for å studere endoftalmitt; Eksperimentelle modeller av endoftalmitt gir imidlertid raske og reproduserbare resultater som kan oversettes til fremgang i standardbehandling, noe som resulterer i bedre visuelt resultat for pasientene.

Glasslegemet i museøyet er ca. 7 μL⁴⁰. Dette lille v…

Materials

2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA