त्रि-आयामी सह-संस्कृति प्रणाली, एनआईसीओ -1 का उपयोग करके डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम जैसी कोशिकाओं के एंजियोजेनेटिक गुणों का मूल्यांकन
Summary
डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम सेल (ओसीएससी) कैंसर दीक्षा, पुनरावृत्ति, चिकित्सीय प्रतिरोध और मेटास्टेसिस के लिए जिम्मेदार हैं। ओसीएससी संवहनी आला को ओसीएससी के आत्म-नवीकरण को बढ़ावा देने के लिए माना जाता है, जिससे केमोरेसिस्टेंस होता है। यह प्रोटोकॉल विट्रो में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ओसीएससी संवहनी आला मॉडल स्थापित करने के लिए आधार प्रदान करता है।
Abstract
कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) एक सहायक आला में रहते हैं, जो आसन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं, वाहिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स से युक्त एक माइक्रोएन्वायरमेंट का गठन करते हैं। एंडोथेलियम के विकास में भाग लेने के लिए सीएससी की क्षमता एक महत्वपूर्ण विशेषता का गठन करती है जो सीधे ट्यूमरजेनिसिस और ट्यूमर मेटास्टेसिस के तंत्र की सामान्य समझ में योगदान देती है। इस काम का उद्देश्य डिम्बग्रंथि के कैंसर स्टेम कोशिकाओं (ओसीएससी) की ट्यूमर-दीक्षा क्षमता की जांच करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति स्थापित करना है। यहां, हमने इन विट्रो सह-संस्कृति मॉडल एनआईसीओ -1 का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं और ओसीएससी के बीच नियोवैस्कुलराइजेशन तंत्र की जांच की। यह प्रोटोकॉल एक समय पाठ्यक्रम तरीके से ओसीएससी के आसपास के नियोवैस्कुलराइजेशन चरण के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। तकनीक ट्यूमर मेटास्टेसिस में ओसीएससी के एंजियोजेनेटिक गुणों के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।
Introduction
डिम्बग्रंथि का कैंसर दुनिया भर में महिलाओं में आठवां सबसे आम घातक है, जिसमें लगभग 300,000 नए निदान और अनुमानित 180,000 मौतें सालानाहैं। प्रारंभिक निदान में, डिम्बग्रंथि का कैंसर अक्सर गंभीर लक्षणों के साथ प्रस्तुत होता है, लगभग 75% रोगी पहले से ही चरण III-IV में होते हैं। तदनुसार, 5 साल की जीवित रहने की दर <30% है और स्त्री रोग संबंधी कैंसर2 में मृत्यु दर सबसे अधिक है, डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए उपचार की दक्षता नैदानिक कारकों पर अत्यधिक निर्भर है जैसे कि डिबल्किंग सर्जरी की सफल उपलब्धि, कीमोथेरेपी के प्रतिरोध और प्रारंभिक चिकित्सा के बाद पुनरावृत्ति।
डिम्बग्रंथि के कैंसर के ऊतकों को पदानुक्रमित रूप से व्यवस्थित किया जाता है, जिसमें सभी ट्यूमर घटक वंशज पैदा करने में समान रूप से सक्षम नहीं होते हैं। एक विषम ट्यूमर सेल आबादी को आत्म-नवीनीकृत और उत्पादन करने में सक्षम एकमात्र कोशिकाओं को कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) 3 का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता है। सीएससी आत्म-नवीकरण और ट्यूमर दीक्षा एक सहायक आला बनाए रखने के उद्देश्य से अपने ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को फिर से तैयार करने के लिए एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा देने के साथ होती है। हालांकि, पिछले मॉडलों का उपयोग इन विट्रो विश्लेषणों के लिए नहीं किया जा सका क्योंकि नैदानिक नमूनों से प्राप्त सीएससी की खेती की सीमित प्रजनन क्षमता के कारण कई पासिंग के बाद स्फेरॉइड के विघटन के कारण। हाल ही में, रोगियों से सीएससी की खेती करने के लिए प्रयोगात्मक तरीकों को कई अनुप्रयोगों 4,5,6,7 के लिए विकसित किया गया है। विशेष रूप से, सीरम-मुक्त माध्यम के साथ अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेटों में स्फेरॉइड बनाकर बढ़ने के लिए सीएससी की विशेषता का फायदा उठाकर, खेती किए गए सीएससी को स्टेम-सेल सतह मार्कर व्यक्त करने के लिए प्रेरित किया जाता है जो मल्टीलाइनेज भेदभाव क्षमता 8,9 के साथ सामान्य ट्यूमर कोशिकाओं में व्यक्त नहीं किया जाता है।
हाल के आंकड़ों से पता चला है कि पेरिटोनियम में प्रसार के रूप में देखे गए निष्क्रिय डिम्बग्रंथि (ओ) सीएससी की दृढ़ता आवर्तक ट्यूमर10 के रूप में उनके पुनर्जनन से जुड़ी है। ओसीएससी की आणविक और जैविक विशेषताओं को समझना इस प्रकार इन कोशिकाओं के प्रभावी लक्ष्यीकरण और उन्मूलन की अनुमति दे सकता है, जिसके परिणामस्वरूप संभावित ट्यूमर छूट हो सकती है। विशेष रूप से, एंजियोजेनेसिस11 में सीएससी भूमिकाओं की सेलुलर और आणविक यांत्रिक विशेषताओं के बारे में बहुत कम जाना जाता है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल में हमने सह-संस्कृति मॉडल का उपयोग करके एंडोथेलियल कोशिकाओं की एंजियोजेनिक संपत्ति की जांच करने के लिए एक इन विट्रो सेटिंग में रोगी-व्युत्पन्न ओसीएससी का उपयोग किया, जो नैदानिक सेटिंग में मेटास्टैटिक साइट पर सीएससी और एंडोथेलियल कोशिकाओं के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल कर सकता है। अंततः, जैसा कि नियोवैस्कुलराइजेशन ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस का समर्थन करने के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया का गठन करता है, इसके तंत्र की बेहतर समझ मेटास्टैटिक साइट पर ओसीएससी के लिए एक नवीन लक्ष्यीकरण चिकित्सा के विकास की अनुमति देगी।
यहां, हम सीएससी के आसपास के नियोवैस्कुलराइजेशन चरण को एक समय पाठ्यक्रम तरीके से देखने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल के लाभ में 3 डी सह-संस्कृति प्रणाली, एनआईसीओ -1 का उपयोग करके पूरी तरह से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जांच की अनुमति देना शामिल है, जिससे एंडोथेलियल सेल एंजियोजेनेसिस के दौरान ओसीएससी-व्युत्पन्न ट्यूमर-दीक्षा क्षमता के रोगियों पर प्रभावों के अवलोकन की अनुमति मिलती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि इन विट्रो सेटिंग में ओसीएससी के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल कैसे करें। विधि का प्राथमिक घटक एनआईसीओ -1 प्रणाली, एक अप्रत्यक्ष ट्रांसवेल सह-संस्कृति प्रणाली क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को शिक्षा, विज्ञान और संस्कृति मंत्रालय, जापान से वैज्ञानिक अनुसंधान सी (केएन को अनुदान संख्या 19के09834) के लिए अनुदान-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
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