הערכת התכונות האנגיוגנטיות של תאים דמויי גזע של סרטן השחלות באמצעות מערכת תרבית קו-תרבית תלת-ממדית, NICO-1
Summary
תאי גזע של סרטן השחלות (OCSC) אחראים על התחלת סרטן, הישנות, עמידות טיפולית וגרורות. נישת כלי הדם OCSC נחשבת לקידום התחדשות עצמית של OCSCs, מה שמוביל לכימורסטיות. פרוטוקול זה מספק את הבסיס להקמת מודל נישה כלי דם OCSC הניתן לשחזור במבחנה.
Abstract
תאי גזע סרטניים (CSCs) שוכנים בנישה תומכת, המהווה מיקרו-סביבה המורכבת מתאים סטרומליים סמוכים, כלי דם ומטריצה חוץ-תאית. היכולת של CSCs להשתתף בפיתוח אנדותל מהווה מאפיין חשוב התורם ישירות להבנה הכללית של מנגנוני הגידול וגרורות הגידול. מטרת עבודה זו היא לבסס מתודולוגיה הניתנת לשחזור כדי לחקור את יכולת ייזום הגידול של תאי גזע סרטניים בשחלות (OCSCs). כאן בחנו את מנגנון הניאו-וסקולריזציה בין תאי אנדותל ל-OCSCs יחד עם השינויים המורפולוגיים של תאי אנדותל באמצעות מודל התרבית במבחנה NICO-1. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של שלב הניאו-וסקולריזציה המקיף את ה-OCSCs באופן של קורס זמן. הטכניקה יכולה לספק תובנה לגבי התכונות האנגיוגנטיות של OCSCs בגרורות סרטניות.
Introduction
סרטן השחלות הוא הממאירות השמינית בשכיחותה בקרב נשים ברחבי העולם, עם כ-300,000 אבחנות חדשות וכ-180,000 מקרי מוות בשנה1. באבחון הראשוני, סרטן השחלות מופיע לעתים קרובות עם תסמינים חמורים, כאשר כ -75% מהחולים כבר בשלב III-IV. בהתאם לכך, שיעור ההישרדות ל-5 שנים הוא <30% ושיעור התמותה הוא הגבוה ביותר בקרב סוגי סרטן גינקולוגיים2, כאשר יעילות הטיפול בסרטן השחלות תלויה מאוד בגורמים קליניים כגון ההישג המוצלח של ניתוח הפחתה, עמידות לכימותרפיה והישנות לאחר הטיפול הראשוני.
רקמות סרטן השחלות מאורגנות באופן היררכי, כאשר לא כל מרכיבי הגידול מסוגלים באותה מידה לייצר צאצאים. התאים היחידים המסוגלים לחדש את עצמם ולייצר אוכלוסיית תאי גידול הטרוגנית נחשבים כמייצגים תאי גזע סרטניים (CSCs)3. התחדשות עצמית של CSC וייזום גידולים מלווים בקידום אנגיוגנזה לשיפוץ המיקרו-סביבה של הגידול שלהם לצורך שמירה על נישה תומכת. עם זאת, לא ניתן היה להשתמש במודלים קודמים לניתוחים חוץ-גופיים בגלל יכולת השחזור המוגבלת של גידול CSCs שמקורם בדגימות קליניות עקב שיבוש של ספרואידים לאחר מעבר מרובה. לאחרונה, פותחו שיטות ניסיוניות לטיפוח CSCs מחולים עבור מספר יישומים 4,5,6,7. בפרט, על ידי ניצול המאפיין של CSCs לגדול על ידי יצירת ספרואידים בלוחות חיבור נמוכים במיוחד עם מדיום ללא סרום, ה- CSCs המעובדים מושרים לבטא סמן פני שטח של תאי גזע שאינו מתבטא בתאי גידול רגילים עם פוטנציאל התמיינות רב-ליניארי 8,9.
נתונים עדכניים הראו כי ההתמדה של שחלות רדומות (O)CSCs המוצגות כהפצה בצפק קשורה להתחדשותן כגידולים חוזרים10. הבנת התכונות המולקולריות והביולוגיות של OCSCs עשויה אפוא לאפשר מיקוד יעיל והשמדה של תאים אלה, וכתוצאה מכך הפוגה פוטנציאלית של הגידול. בפרט, מעט מאוד ידוע לגבי התכונות המכניסטיות התאיות והמולקולריות של תפקידי CSCs באנגיוגנזה11. לכן, בפרוטוקול הנוכחי השתמשנו ב-OCSCs שמקורם בחולה במסגרת מבחנה כדי לחקור את התכונה האנגיוגנית של תאי אנדותל באמצעות מודל התרבית המשותפת, שעשוי לחקות את המיקרו-סביבה של תאי CSCs ואנדותל באתר הגרורתי בסביבה הקלינית. בסופו של דבר, מכיוון שניאו-וסקולריזציה מהווה תהליך קריטי הנחוץ לתמיכה בצמיחת הגידול ובגרורות, הבנה טובה יותר של המנגנון שלו תאפשר פיתוח של טיפול מיקוד חדשני עבור OCSCs באתר הגרורתי.
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להמחיש את שלב הניאו-וסקולריזציה סביב ה-CSCs באופן של קורס זמן. היתרון של הפרוטוקול כולל מתן אפשרות למחקרים הניתנים לשחזור מלא באמצעות מערכת התרבית התלת-ממדית, NICO-1, ובכך לאפשר תצפית על ההשפעות על המטופלים של יכולת ייזום הגידול שמקורה ב-OCSC במהלך אנגיוגנזה של תאי אנדותל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר כיצד לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול של OCSCs בסביבה חוץ-גופית. המרכיב העיקרי של השיטה מהווה את מודל החקלאות הניתן לשחזור ביותר המתקבל באמצעות מערכת NICO-1, מערכת קו-תרבית עקיפה של טרנסוול. רבים ממודלים של קוקולטורה הזמינים כיום בוחנים את ההשפעות של מגע ישיר בין תאים על אוכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי C (מענק מס’ 19K09834 לק.נ.) ממשרד החינוך, המדע והתרבות, יפן.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
