Summary
난소암 줄기세포(OCSC)는 암 시작, 재발, 치료 내성 및 전이를 담당합니다. OCSC 혈관 틈새는 OCSC의 자가 재생을 촉진하여 화학 내성을 유발하는 것으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 시험관 내에서 재현 가능한 OCSC 혈관 틈새 모델을 구축하기 위한 기초를 제공합니다.
Abstract
암 줄기 세포 (CSC)는지지 틈새 시장에 상주하여 인접한 기질 세포, 혈관 및 세포 외 기질로 구성된 미세 환경을 구성합니다. 내피 발달에 참여하는 CSC의 능력은 종양 발생 및 종양 전이의 메커니즘에 대한 일반적인 이해에 직접적으로 기여하는 중요한 특성을 구성합니다. 이 연구의 목적은 난소암 줄기세포(OCSC)의 종양 개시 능력을 조사하기 위한 재현 가능한 방법론을 확립하는 것입니다. 본 발명에서는 시험관 내 공동 배양 모델 NICO-1을 사용하여 내피 세포와 OCSC 사이의 신생혈관형성 메커니즘과 내피 세포의 형태학적 변화를 조사했습니다. 이 프로토콜은 OCSC를 둘러싼 신생 혈관 단계를 시간 경과 방식으로 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 종양 전이에서 OCSC의 혈관 신생 특성에 관한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
Introduction
난소암은 전 세계적으로 여성에게 8번째로 흔한 악성 종양으로, 매년 약 300,000건의 새로운 진단과 약 180,000명의 사망이발생합니다1. 초기 진단에서 난소 암은 종종 심각한 증상을 나타내며 환자의 약 75 %가 이미 III-IV 기에 있습니다. 이에 따라 부인암2 중 5년 생존율이 <30%, 사망률이 가장 높으며, 난소암의 치료 효율은 용적폐 수술의 성공적 성취, 항암에 대한 내성, 초기 치료 후 재발 등의 임상적 요인에 크게 의존한다.
난소암 조직은 계층적으로 구성되어 있으며 모든 종양 구성 요소가 동등하게 자손을 생성할 수 있는 것은 아닙니다. 자가 재생하고 이질적인 종양 세포 집단을 생성할 수 있는 유일한 세포는 암 줄기 세포(CSC)를 나타내는 것으로 간주됩니다3. CSC 자가 재생 및 종양 개시는 지지적 틈새를 유지하기 위한 목적으로 종양 미세환경을 리모델링하기 위한 혈관신생의 촉진을 동반한다. 그러나 이전 모델은 다중 계대 배양 후 스페로이드의 파괴로 인해 임상 샘플에서 파생된 CSC 배양의 재현성이 제한적이기 때문에 시험관 내 분석에 활용할 수 없었습니다. 보다 최근에, 환자로부터 CSC를 배양하기 위한 실험적 방법이여러 응용 4,5,6,7을 위해 개발되었다. 특히, 배양된 줄기세포는 무혈청 배지로 초저 부착판에서 스페로이드를 형성하여 성장하는 CSC의 특성을 이용함으로써, 다계통 분화 가능성이 있는 정상 종양세포에서는 발현되지 않는 줄기세포 표면 마커를 발현하도록 유도한다(8,9).
최근 데이터에 따르면 복막에서 전파로 시각화 된 휴면 난소 (O) CSC의 지속성은 재발 성 종양10으로 재생되는 것과 관련이 있습니다. 따라서 OCSC의 분자 및 생물학적 특징을 이해하면 이러한 세포를 효과적으로 표적화하고 박멸하여 잠재적인 종양 완화를 초래할 수 있습니다. 특히, 혈관신생11에서 CSCs 역할의 세포 및 분자 기계론적 특징에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 따라서, 본 프로토콜에서는 임상 환경에서 전이 부위에서 CSC 및 내피 세포의 종양 미세 환경을 모방 할 수있는 공동 배양 모델을 사용하여 내피 세포의 혈관 신생 특성을 조사하기 위해 시험관 내 설정에서 환자 유래 OCSC를 사용했습니다. 궁극적으로 신생혈관형성은 종양 성장과 전이를 지원하는 데 필요한 중요한 과정을 구성하기 때문에 그 메커니즘을 더 잘 이해하면 전이 부위에서 OCSC에 대한 새로운 표적 요법을 개발할 수 있습니다.
여기에서는 CSC를 둘러싼 신생혈관화 단계를 시간 경과 방식으로 시각화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 장점은 3D 공동 배양 시스템인 NICO-1을 사용하여 완전히 재현 가능한 조사를 허용하여 내피 세포 혈관신생 동안 OCSC 유래 종양 개시 능력이 환자에 미치는 영향을 관찰할 수 있다는 것입니다.
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Protocol
모든 절차는 인간 복지 윤리위원회가 승인 한 의정서에 따라 수행되었습니다. 모든 환자는 샘플의 연구 사용에 대한 서면 동의서를 제출했으며,이 연구를위한 조직의 수집 및 사용은 테이 쿄 대학의 인간 게놈, 유전자 분석 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 레벨 2 생물안전 캐비닛에서 난소암 및 복수 환자의 난소암 줄기세포(OCSC) 분리 및 배양
- 천자를 통해 얻은 인간 난소 암 복수에서 암 줄기 세포를 분리합니다. 충분한 수의 암 줄기 세포를 채취하기 위해 환자로부터 최소 100-250mL의 복수를 수집하십시오. 추가적으로, 암 줄기 세포 마커 (즉, EpCAM, 칼레티닌, CD133, CD44, CD45, ALDH1, 및 Oct4) 및 난소암 마커 (pAX-8, WT-1)의 발현 프로필을 유세포분석에 의해 평가한다.
- 복수 흡인 후 24시간 이내에 실온에서 10분 동안 300 x g 에서 인간 난소암 복수를 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 OCSC 배지 2mL와 30% 히스토덴츠/인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 용액 8mL를 추가합니다.
- OCSC 배지 준비: 스템프로 hESC 보충제, L-글루타민(글루타맥스 배지), 25% BSA, 100μM 2-메르캅토에탄올, 8ng/mL FGF 염기성, 10μM 인슐린 및 20μM Y-27632가 포함된 DMEM⁄F-12.
- 15mL 튜브의 1.1.2단계의 세포 용액에 2mL의 OCSC 배지를 조심스럽게 오버레이하고 제동 없이 스윙 버킷 로터에서 실온에서 20분 동안 450 x g 로 원심분리합니다.
- OCSC 층(간기에서 방해받지 않음)을 전사 피펫으로 새 15mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
- PBS로 최대 15mL까지 채웁니다. 실온에서 5분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 상청액을 제거한다.
- 세포 펠릿을 OCSC 배지에 재현탁하고 초저 부착 배양 접시에 시드합니다. 배양물은 5%CO2에서 37°C에서 유지되어야 한다.
- 3 일마다 매체를 교체하십시오. 배양 접시를 약 1 분 동안 조심스럽게 서서 상청액의 일부를 버리고 새로운 배지를 첨가하십시오.
- CSC의 통과
- 15mL 튜브에 OCSC를 수집하고 실온에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고, PBS로 채우고, 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 제거하고, 단백질 분해 및 콜라겐분해 효소(예: AccuMax)로 구성된 세포 분리 용액 1mL를 추가하고, 37°C에서 10분 동안 배양한다.
- 피펫팅으로 잘 혼합하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 세포가 단일 현탁액에 있는지 확인하십시오.
- 피펫팅으로 잘 혼합하고 PBS로 채우고 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 OCSC 배지에 재현탁시켜 초저 부착 배양 접시에 후속 시딩하고 5%CO2에서 37°C에서 유지한다.
2. HUEhT-1 내피 세포 배양
- HUEhT-1 세포의 통과
- HUEhT-1 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한다.
- 0.025% 트립신 1mL를 넣고 실온에서 3분간 배양합니다.
- 내피 세포 성장 배지 2 5mL를 추가하고 15mL 튜브에 세포를 모은 다음 실온에서 5분 동안 200 x g 에서 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 HUEhT-1 배지에 재현탁하고, 콜라겐이 코팅된 배양 접시에 세포를 시드한 다음, 5%CO2에서 37°C에서 유지하였다.
- 3 일마다 매체를 교체하십시오.
3. HUEhT-1 세포를 이용한 튜브 형성 분석을 위한 NICO-1 공동배양 플레이트의 제조
- NICO-1을 조립하고 세포외 기질계 하이드로겔(Matrigel Matrix)로 코팅한다.
- 제조업체의 지침에 따라 NICO-1의 한쪽을 조립하고 얼음 위에 보관하십시오.
- NICO-1의 표면을 300 μL의 차가운 PBS로 덮은 다음 완충액을 제거합니다.
- 냉각된 세포외 기질 기반 하이드로겔 300μL를 추가하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
- 평형을 이루려면 필터를 100% 에탄올에 담근 다음 13mm ICCP 필터(0.6μm)를 PBS로 1분 동안 세척합니다.
- 본체 부품 A(오른쪽 챔버) 및 B(왼쪽 챔버)를 포함한 NICO-1을 O 링 및 평형 필터와 함께 조립합니다.
4. HUEhT-1 세포 및 CSC를 NICO-1 시스템에 파종
- 세포 단층을 트립신화하고 세포를 2% 우태아 송아지 혈청으로 내피 세포 성장 배지에 재현탁하여 HUEhT-1 세포 현탁액을 준비합니다.
- 1.2 mL의 세포 현탁액(1.5 x 105 세포)을 각 세포외 기질 기반 하이드로겔 코팅 웰에 추가합니다.
- 5일 동안 배양한 OCSC 1.5mL를 다른 웰에 추가합니다.
- NICO-1을 5%CO2 중 37°C에서 인큐베이션하고; 튜브 형성은 가지의 수를 통해 측정 된 세포 외 기질 기반 하이드로 겔에서 현미경 및 네트워크 형성으로 관찰 할 수 있습니다.
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Representative Results
스페로이드에 대한 장기간 안정적인 배양을 수행하기 위해 수술 또는 천자 중 진행성 난소암 환자로부터 얻은 복수액을 수집했습니다. 여기에서는 CSC1 및 CSC2라고 하는 난소 CSC의 장기 스페로이드 배양 사례를 제시합니다. 두 세포주 모두 동일한 진단 및 조직 학적 프로파일을 가지고 있습니다. OCSC를 둘러싼 내피 세포의 신생 혈관을 유도하는 데 필요한 내피 세포와의 상호 작용의 기초가되는 OCSC의 기계 론적 역할은 아직 알려지지 않았습니다. 따라서 우리는 전이 부위에서 CSC 혈관 틈새 발달 과정을 명확히하는 것을 목표로했습니다. 우리는 시험관 내 공동 배양 모델 NICO-1을 사용하여 내피 세포 (HUEhT-1)와 OCSC 간의 상호 작용을 조사했습니다. 도 1은 CSC1 및 CSC2에 의해 유도된 튜브 형성 활성의 비교를 나타낸다. 형성된 혈관 튜브의 수는 CSC2와의 공동 배양에서 시간이 지남에 따라 극적으로 증가했습니다 (그림 2A). 양성 대조군의 경우, CSC2의 공동 배양없이 VEGF (10 ng / mL)를 처리 한 후 HuEhT-1의 혈관 신생 특성을 보여주는 그림 2B를 제시합니다. 우리는 이제 결과의 기초가되는 세부 메커니즘을 명확히하고 있습니다. 그림 3 는 NICO-1을 이용한 OCSC와 내피세포의 공동배양 모델의 대표 이미지를 나타낸다. HUEhT-1 세포를 CSC2와 20시간 동안 공동 배양하고, 타임랩스 비디오 이미지를 캡처하였다. 도 3A는 20시간 동안의 공동 배양 전후의 CSC2의 표현형을 나타낸다. 도 3B는 동시에 공배양된 HUEhT-1 세포를 나타낸다. HUEhT-1 세포가 CSC2와의 공동 배양 중에 혈관 튜브를 형성했다는 것은 주목할 만합니다 (그림 3C : 비디오 클립).
그림 1: OCSCs 혈관 틈새 모델. OCSC가 내피 세포의 튜브 형성 (혈관 화)을 유도하는 기계 론적 역할은 아직 알려지지 않았습니다. 우리는 시험관 내 공동 배양 모드 인 NICO-1을 사용하여 내피 세포 (HUEhT-1)와 OCSC 간의 상호 작용을 조사했습니다. 이 시스템의 오른쪽 구획은 OCSC를 셀 매체와 함께 고정하는 인서트로 구성됩니다. 왼쪽 구획은 오른쪽 웰과 동일한 배지를 가진 내피 세포와 HUVEC를 포함하는 웰로 구성됩니다.
그림 2: OCSC에 의해 유도된 신생혈관형성 활동의 비교. 시간이 지남에 따라 형성된 혈관 튜브의 수는 CSC2와의 공동 배양시 극적으로 증가했습니다.
그림 3: NICO-1을 사용한 CSC2와 HUEhT-1 세포의 혈관 형성. HUEhT-1 세포는 CSC2와의 공동 배양 동안 혈관 튜브를 형성했습니다.
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Discussion
제시된 프로토콜은 시험관 내 설정에서 OCSC의 종양 미세 환경을 모방하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 주요 구성 요소는 간접 Transwell 공동 배양 시스템인 NICO-1 시스템을 사용하여 얻은 재현성이 높은 공동 배양 모델을 구성합니다. 현재 이용 가능한 많은 공동 배양 모델은 공동 배양 된 세포 집단 12,13,14,15,16,17,18에 대한 직접적인 세포-세포 접촉의 효과를 조사합니다. 공동배양의 효과를 조사하는데 사용될 수 있는 가장 간단한 모델은 2개의 세포 유형의 직접 혼합에 의해 재현될 수 있고, 이형적 및 동형적 상호작용의 정도는 각 세포 유형의 파종 밀도 및 하위집단(19)의 상대적 파종 비율을 변경함으로써 조사될 수 있다. 그러나 현미경으로 독립적으로 관찰 된 공동 배양 효과에 대한 OCSC의 상대적 기여도를 직접 결정하는 것은 각 세포의 정확한 보이지 않기 때문에 어렵습니다. 따라서 이러한 연구는 종종 조건 배지 실험과 병행하여 동반됩니다. 예를 들어, 분리된 공배양 시스템은 종양 미세환경에 대한 파라크린 신호전달의 효과가 관심사항인 연구에서 활용될 수 있다(19). 이에 비해, 본 방법에서는 천연 종양 미세환경의 아키텍처를 모방하는 세포-세포 접촉 및 파라크린 신호전달의 효과를 동시에 평가할 수 있는 모델을 설명합니다.
혈관신생은 난소암의 특징으로서 작용하고, 암세포, 내피 세포, 및 주변 종양 미세환경(20) 사이의 상호작용을 포함하는 그의 진행에 중요한 역할을 한다. 베바시주맙은 진행성 난소암에 대한 병용 화학요법에 사용하기 위해 널리 받아들여진 핵심 분자 표적 약물입니다21. 구체적으로, 베바시주맙은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 단일클론 항체를 구성한다. VEGF는 신생혈관형성을 촉진하고 혈관투과성을 향상시킴으로써 진행성 난소암 또는 복막암에서 복막암의 발병 및 악성 복수의 형성에 기여한다2. 따라서, VEGF 억제는 전이성 부위에서 복수 생성 및 대규모 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 종양 미세 환경 수준에서 VEGF 자극 혈관 내피 세포를 효과적으로 표적화하는 추가 조사가 필요합니다. 그러나 이러한 연구에 마우스 모델과 같은 전임상 모델을 효과적으로 활용하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 인간 VEGF에 대한 베바시주맙의 친화도는 높은 반면 마우스 단백질의 친화도는 더 낮은 것으로 보고되었다23. 이는 마우스 모델을 사용하여 확인된 바와 같이 종양 미세환경에서 신생혈관화에 대한 항-VEGF 메커니즘을 추가로 조사하기 위해 설계된 실험 내에서 베바시주맙의 적용과 관련하여 제한을 시행합니다. 따라서 생체 내 종양 미세 환경의 구성 요소를 요약하기 위해 잘 제어된 아키텍처를 가진 적절한 모델이 필요합니다. 이러한 경우, 우리는 체외 공동 배양 모델 시스템이 환자 유래 OCSC 및 내피 세포의 배양 전반에 걸쳐 세포 행동의 실시간 추적을 허용하고 공동 배양에 반응하여 이러한 개별 세포 하위 집단의 연구를 허용한다는 점에 주목합니다.
OCSC의 역할과 혈관 틈새 시장을 더 잘 이해하면 OCSC에 대한 치료 전략 개발에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다. 대표적인 실험에서 볼 수 있듯이 이 모델의 강점은 임상 환경과 부분적으로 일치하는 것으로 보이는 연구 플랫폼을 제공하여 더 나은 표적화되고 효과적인 신약의 개발 및 테스트를 가능하게 한다는 것입니다. 더 많은 수의 환자 유래 OCSC와 관련된 결과의 직접적인 임상 복제에 대한 추가 연구가 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 일본 문부 과학문화부의 과학 연구 C 보조금(K.N.에 대한 보조금 번호 19K09834)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
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