Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1
Summary
Le cellule staminali del cancro ovarico (OCSC) sono responsabili dell’inizio del cancro, della recidiva, della resistenza terapeutica e delle metastasi. Si ritiene che la nicchia vascolare OCSC promuova l’autorinnovamento degli OCSC, portando alla chemioresistenza. Questo protocollo fornisce la base per stabilire un modello di nicchia vascolare OCSC riproducibile in vitro.
Abstract
Le cellule staminali tumorali (CSC) risiedono in una nicchia di supporto, costituendo un microambiente composto da cellule stromali adiacenti, vasi e matrice extracellulare. La capacità delle CSCs di partecipare allo sviluppo dell’endotelio costituisce una caratteristica importante che contribuisce direttamente alla comprensione generale dei meccanismi della tumorigenesi e delle metastasi tumorali. Lo scopo di questo lavoro è quello di stabilire una metodologia riproducibile per studiare la capacità di inizio del tumore delle cellule staminali tumorali ovariche (OCSC). Qui, abbiamo esaminato il meccanismo di neovascolarizzazione tra cellule endoteliali e OCSC insieme ai cambiamenti morfologici delle cellule endoteliali utilizzando il modello di co-coltura in vitro NICO-1. Questo protocollo consente di visualizzare la fase di neovascolarizzazione che circonda gli OCSC in modo temporizzato. La tecnica può fornire informazioni sulle proprietà angiogenetiche degli OCSC nelle metastasi tumorali.
Introduction
Il cancro ovarico è l’ottavo tumore maligno più comune nelle donne in tutto il mondo, con circa 300.000 nuove diagnosi e circa 180.000 decessi all’anno1. Alla diagnosi iniziale, il carcinoma ovarico si presenta spesso con sintomi gravi, con circa il 75% delle pazienti già allo stadio III-IV. Di conseguenza, il tasso di sopravvivenza a 5 anni è del <30% e il tasso di mortalità è il più alto tra i tumori ginecologici2, con l’efficacia del trattamento per il cancro ovarico che dipende fortemente da fattori clinici come il successo della chirurgia di debulking, la resistenza alla chemioterapia e la recidiva dopo la terapia iniziale.
I tessuti del cancro ovarico sono organizzati gerarchicamente, con non tutti i componenti tumorali ugualmente in grado di generare discendenti. Le uniche cellule in grado di auto-rinnovarsi e produrre una popolazione eterogenea di cellule tumorali sono considerate cellule staminali tumorali (CSCs)3. L’auto-rinnovamento delle CSC e l’iniziazione del tumore sono accompagnati dalla promozione dell’angiogenesi per rimodellare il loro microambiente tumorale allo scopo di mantenere una nicchia di supporto. Tuttavia, i modelli precedenti non potevano essere utilizzati per le analisi in vitro a causa della limitata riproducibilità della coltivazione di CSCs derivate da campioni clinici a causa della rottura degli sferoidi dopo passaggi multipli. Più recentemente, sono stati sviluppati metodi sperimentali per coltivare CSC da pazienti per diverse applicazioni 4,5,6,7. In particolare, sfruttando la caratteristica delle CSCs di crescere formando sferoidi in piastre di attacco ultra-basse con mezzo privo di siero, le CSCs coltivate sono indotte ad esprimere un marcatore di superficie staminale che non è espresso in cellule tumorali normali con potenziale di differenziazione multilineage 8,9.
Dati recenti hanno dimostrato che la persistenza di (O)CSCs ovariche dormienti visualizzate come disseminazione al peritoneo è associata alla loro rigenerazione come tumori ricorrenti10. La comprensione delle caratteristiche molecolari e biologiche degli OCSC può quindi consentire un efficace targeting ed eradicazione di queste cellule, con conseguente potenziale remissione del tumore. In particolare, poco si sa riguardo alle caratteristiche meccanicistiche cellulari e molecolari dei ruoli delle CSCs nell’angiogenesi11. Pertanto, nel presente protocollo abbiamo utilizzato OCSC derivati dal paziente in un setting in vitro per studiare la proprietà angiogenica delle cellule endoteliali utilizzando il modello di co-coltura, che può imitare il microambiente tumorale delle CSCs e delle cellule endoteliali nel sito metastatico in ambito clinico. In definitiva, poiché la neovascolarizzazione costituisce un processo critico necessario per supportare la crescita tumorale e le metastasi, una migliore comprensione del suo meccanismo consentirà lo sviluppo di una nuova terapia mirata per gli OCSC nel sito metastatico.
Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare la fase di neovascolarizzazione che circonda le CSC in un modo di tempo. Il vantaggio del protocollo include la possibilità di indagini completamente riproducibili utilizzando il sistema di co-coltura 3D, NICO-1, consentendo così l’osservazione degli effetti sui pazienti della capacità di iniziazione del tumore derivata da OCSC durante l’angiogenesi delle cellule endoteliali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato descrive come imitare il microambiente tumorale degli OCSC in un ambiente in vitro. La componente principale del metodo è costituita dal modello di cocoltura altamente riproducibile ottenuto utilizzando il sistema NICO-1, un sistema di co-coltura Transwell indiretto. Molti dei modelli di cocoltura attualmente disponibili esaminano gli effetti del contatto diretto cellula-cellula sulle popolazioni cellulari di cocoltura 12,13,14,15,16,17,18.</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un Grant-in-Aid for Scientific Research C (grant no. 19K09834 to K.N.) del Ministero dell’Istruzione, della Scienza e della Cultura, Giappone.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
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