Avaliando as propriedades angiogenéticas de células-tronco do câncer de ovário usando o Sistema de Cocultura Tridimensional, NICO-1
Summary
As células-tronco do câncer de ovário (OCSC) são responsáveis pelo início, recorrência, resistência terapêutica e metástase do câncer. Considera-se que o nicho vascular do OCSC promove a auto-renovação dos OCSCs, levando à quimiorresistência. Este protocolo fornece a base para o estabelecimento de um modelo de nicho vascular OCSC reprodutível in vitro.
Abstract
As células-tronco cancerígenas (CSCs) residem em um nicho de suporte, constituindo um microambiente composto por células estromais adjacentes, vasos e matriz extracelular. A capacidade das CSCs de participar do desenvolvimento do endotélio constitui uma característica importante que contribui diretamente para a compreensão geral dos mecanismos de tumorigênese e metástase tumoral. O objetivo deste trabalho é estabelecer uma metodologia reprodutível para investigar a capacidade de iniciação tumoral de células-tronco de câncer de ovário (OCSCs). Neste trabalho, examinamos o mecanismo de neovascularização entre células endoteliais e OCSCs, juntamente com as alterações morfológicas das células endoteliais, usando o modelo de co-cultura in vitro NICO-1. Este protocolo permite a visualização da etapa de neovascularização em torno dos OCSCs de forma temporal. A técnica pode fornecer informações sobre as propriedades angiogenéticas dos OCSCs na metástase tumoral.
Introduction
O câncer de ovário é a oitava neoplasia maligna mais comum em mulheres em todo o mundo, com aproximadamente 300.000 novos diagnósticos e uma estimativa de 180.000 mortes anuais1. No diagnóstico inicial, o câncer de ovário geralmente se apresenta com sintomas graves, com cerca de 75% das pacientes já no estágio III-IV. Assim, a taxa de sobrevida em 5 anos é de <30% e a taxa de mortalidade é a mais alta entre os cânceres ginecológicos2, com a eficiência do tratamento para o câncer de ovário sendo altamente dependente de fatores clínicos, como a realização bem-sucedida da cirurgia de debulking, resistência à quimioterapia e recorrência após a terapia inicial.
Os tecidos do câncer de ovário são hierarquicamente organizados, com nem todos os componentes do tumor sendo igualmente capazes de gerar descendentes. As únicas células capazes de se auto-renovar e produzir uma população heterogênea de células tumorais são consideradas como representando células-tronco cancerígenas (CSCs)3. A auto-renovação do CSC e o início do tumor são acompanhados pela promoção da angiogênese para remodelar seu microambiente tumoral com a finalidade de manter um nicho de suporte. No entanto, modelos anteriores não puderam ser utilizados para análises in vitro devido à reprodutibilidade limitada do cultivo de CSCs derivadas de amostras clínicas devido à ruptura de esferoides após múltiplas passagens. Mais recentemente, métodos experimentais para cultivar CSCs de pacientes têm sido desenvolvidos para diversas aplicações 4,5,6,7. Em particular, ao explorar a característica de crescimento das CSCs formando esferoides em placas de fixação ultrabaixa com meio livre de soro, as CSCs cultivadas são induzidas a expressar um marcador de superfície de células-tronco que não é expresso em células tumorais normais com potencial de diferenciação de múltiplas linhagens 8,9.
Dados recentes têm mostrado que a persistência de (O)CSCs ovarianos dormentes visualizados como disseminação no peritônio está associada à sua regeneração como tumores recorrentes10. A compreensão das características moleculares e biológicas dos OCSCs pode, portanto, permitir o direcionamento e a erradicação efetivos dessas células, resultando em potencial remissão tumoral. Em particular, pouco se sabe sobre as características mecanicistas celulares e moleculares dos papéis das CSCs na angiogênese11. Portanto, no presente protocolo, utilizamos OCSCs derivados de pacientes em um ambiente in vitro para investigar a propriedade angiogênica de células endoteliais usando o modelo de cocultura, que pode imitar o microambiente tumoral de CSCs e células endoteliais no local metastático no ambiente clínico. Em última análise, como a neovascularização constitui um processo crítico necessário para apoiar o crescimento e a metástase do tumor, uma melhor compreensão de seu mecanismo permitirá o desenvolvimento de uma nova terapia direcionada para OCSCs no local metastático.
Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar a etapa de neovascularização em torno das CSCs de forma temporal. A vantagem do protocolo inclui permitir investigações totalmente reprodutíveis usando o sistema de cocultura 3D, NICO-1, permitindo assim a observação dos efeitos em pacientes da capacidade de iniciação de tumores derivados do OCSC durante a angiogênese de células endoteliais.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado descreve como imitar o microambiente tumoral de OCSCs em um ambiente in vitro. O componente primário do método constitui o modelo de cocultura altamente reprodutível obtido usando o sistema NICO-1, um sistema de co-cultura Transwell indireto. Muitos dos modelos de cocultura atualmente disponíveis examinam os efeitos do contato direto célula-célula em populações celulares cocultivadas 12,13,14,15,16,17,18.<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research C (grant no. 19K09834 to K.N.) do Ministério da Educação, Ciência e Cultura, Japão.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
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