Eierstokkankerstamcellen (OCSC) zijn verantwoordelijk voor kankerinitiatie, recidief, therapeutische resistentie en metastase. De OCSC vasculaire niche wordt beschouwd als het bevorderen van zelfvernieuwing van OCSC’s, wat leidt tot chemoresistance. Dit protocol vormt de basis voor het opzetten van een reproduceerbaar OCSC vasculair nichemodel in vitro.
Kankerstamcellen (CSC’s) bevinden zich in een ondersteunende niche en vormen een micro-omgeving die bestaat uit aangrenzende stromale cellen, bloedvaten en extracellulaire matrix. Het vermogen van CSC’s om deel te nemen aan de ontwikkeling van endotheel vormt een belangrijk kenmerk dat direct bijdraagt aan het algemene begrip van de mechanismen van tumorigenese en tumormetastase. Het doel van dit werk is om een reproduceerbare methodologie vast te stellen om het tumorinitiatievermogen van eierstokkankerstamcellen (OCSC’s) te onderzoeken. Hierin onderzochten we het neovascularisatiemechanisme tussen endotheelcellen en OCSC’s, samen met de morfologische veranderingen van endotheelcellen met behulp van het in vitro co-kweekmodel NICO-1. Dit protocol maakt visualisatie van de neovascularisatiestap rond de OCSC’s mogelijk op een tijdsverloopmanier. De techniek kan inzicht geven in de angiogenetische eigenschappen van OCSC’s bij tumormetastase.
Eierstokkanker is de achtste meest voorkomende maligniteit bij vrouwen wereldwijd, met ongeveer 300.000 nieuwe diagnoses en naar schatting 180.000 sterfgevallen per jaar1. Bij de eerste diagnose presenteert eierstokkanker zich vaak met ernstige symptomen, waarbij ongeveer 75% van de patiënten zich al in stadium III-IV bevindt. Dienovereenkomstig is de 5-jaarsoverleving <30% en het sterftecijfer is het hoogste onder gynaecologische kankers2, waarbij de efficiëntie van de behandeling van eierstokkanker sterk afhankelijk is van klinische factoren zoals het succesvol uitvoeren van debulkingchirurgie, resistentie tegen chemotherapie en herhaling na de initiële therapie.
Eierstokkankerweefsels zijn hiërarchisch georganiseerd, waarbij niet alle tumorcomponenten even goed in staat zijn om nakomelingen te genereren. De enige cellen die in staat zijn zichzelf te vernieuwen en een heterogene tumorcelpopulatie te produceren, worden beschouwd als kankerstamcellen (CSC’s)3. CSC-zelfvernieuwing en tumorinitiatie gaan gepaard met de bevordering van angiogenese om hun tumormicro-omgeving te hermodelleren met als doel een ondersteunende niche te behouden. Eerdere modellen konden echter niet worden gebruikt voor in vitro analyses vanwege de beperkte reproduceerbaarheid van het kweken van CSC’s afgeleid van klinische monsters als gevolg van de verstoring van sferoïden na meervoudige passaging. Meer recent zijn experimentele methoden ontwikkeld om CSC’s van patiënten te kweken voor verschillende toepassingen 4,5,6,7. In het bijzonder, door gebruik te maken van het kenmerk van CSC’s om te groeien door sferoïden te vormen in ultralage hechtingsplaten met serumvrij medium, worden de gecultiveerde CSC’s geïnduceerd om een stamceloppervlakmarker tot expressie te brengen die niet tot expressie komt in normale tumorcellen met multilineaire differentiatiepotentiaal 8,9.
Recente gegevens hebben aangetoond dat de persistentie van slapende ovariële (O) CSC’s gevisualiseerd als verspreiding aan het peritoneum geassocieerd is met hun regeneratie als terugkerende tumoren10. Inzicht in de moleculaire en biologische kenmerken van OCSC’s kan dus effectieve targeting en uitroeiing van deze cellen mogelijk maken, wat resulteert in potentiële tumorremissie. In het bijzonder is er weinig bekend over de cellulaire en moleculaire mechanistische kenmerken van CSC-rollen in angiogenese11. Daarom hebben we in het huidige protocol patiënt-afgeleide OCSC’s in een in vitro setting gebruikt om de angiogene eigenschap van endotheelcellen te onderzoeken met behulp van het co-kweekmodel, dat de tumormicro-omgeving van CSC’s en endotheelcellen op de gemetastaseerde plaats in de klinische setting kan nabootsen. Uiteindelijk, aangezien neovascularisatie een kritisch proces vormt dat nodig is om tumorgroei en metastase te ondersteunen, zal een beter begrip van het mechanisme de ontwikkeling van een nieuwe targetingtherapie voor OCSC’s op de gemetastaseerde plaats mogelijk maken.
Hier presenteren we een protocol om de neovascularisatiestap rond de CSC’s op een tijdsverloopmanier te visualiseren. Het voordeel van het protocol is het mogelijk maken van volledig reproduceerbaar onderzoek met behulp van het 3D-cocultuursysteem NICO-1, waardoor observatie van de effecten op patiënten van het ocsc-afgeleide tumorinitiatievermogen tijdens endotheelcelangiogenese mogelijk is.
Het gepresenteerde protocol beschrijft hoe de tumormicro-omgeving van OCSC’s in een in vitro setting kan worden nagebootst. De primaire component van de methode vormt het zeer reproduceerbare cocultuurmodel dat is verkregen met behulp van het NICO-1-systeem, een indirect Transwell-cocultuursysteem. Veel van de momenteel beschikbare cocultuurmodellen onderzoeken de effecten van direct cel-celcontact op coculturele celpopulaties 12,13,14,15,16,17,18.<sup…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research C (subsidie nr. 19K09834 aan K.N.) van het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Cultuur, Japan.
0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
15 mL tube | Nunc | 339650 | |
200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
50 mL tube | Corning | 430290 | |
AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
Histodenz | SIGMA | D2158 | |
HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
Y-27632 | WAKO | 253-00513 |