Evaluering av angiogenetiske egenskaper av stamceller for eggstokkreft ved hjelp av det tredimensjonale kokultursystemet, NICO-1
Summary
Stamceller for eggstokkreft (OCSC) er ansvarlige for kreftinitiering, tilbakefall, terapeutisk resistens og metastase. OCSC vaskulær nisje anses å fremme selvfornyelse av OCSC, noe som fører til kjemoresistens. Denne protokollen gir grunnlag for å etablere en reproduserbar OCSC vaskulær nisjemodell in vitro.
Abstract
Kreftstamceller (CSC) bor i en støttende nisje, som utgjør et mikromiljø bestående av tilstøtende stromale celler, kar og ekstracellulær matrise. CSCs evne til å delta i utviklingen av endotel utgjør en viktig egenskap som direkte bidrar til den generelle forståelsen av mekanismene for tumorigenese og tumormetastase. Formålet med dette arbeidet er å etablere en reproduserbar metodikk for å undersøke tumorinitieringsevnen til stamceller for eggstokkreft (OCSC). Her undersøkte vi neovaskulariseringsmekanismen mellom endotelceller og OCSC-er sammen med de morfologiske endringene av endotelceller ved hjelp av in vitro-kokulturmodellen NICO-1. Denne protokollen tillater visualisering av neovaskulariseringstrinnet rundt OCSC-ene på en tidskursmåte. Teknikken kan gi innsikt i de angiogenetiske egenskapene til OCSCs i tumormetastase.
Introduction
Eggstokkreft er den åttende vanligste maligniteten hos kvinner over hele verden, med ca. 300 000 nye diagnoser og anslagsvis 180 000 dødsfall årlig1. Ved første diagnose presenterer eggstokkreft ofte alvorlige symptomer, med ca 75% av pasientene allerede i stadium III-IV. Følgelig er den 5-årige overlevelsesraten <30% og dødeligheten er den høyeste blant gynekologiske kreftformer2, med effektiviteten av behandlingen for eggstokkreft som er svært avhengig av kliniske faktorer som vellykket gjennomføring av debulking kirurgi, motstand mot kjemoterapi og tilbakefall etter den første behandlingen.
Eggstokkreftvev er hierarkisk organisert, med ikke alle tumorkomponenter som er like i stand til å generere etterkommere. De eneste cellene som er i stand til å fornye seg selv og produsere en heterogen tumorcellepopulasjon, anses å representere kreftstamceller (CSCs)3. CSC selvfornyelse og tumorinitiering ledsages av fremme av angiogenese for å omforme deres tumormikromiljø med det formål å opprettholde en støttende nisje. Tidligere modeller kunne imidlertid ikke brukes til in vitro-analyser på grunn av den begrensede reproduserbarheten av å dyrke CSC-er avledet fra kliniske prøver på grunn av forstyrrelsen av sfæroider etter flere passeringer. Mer nylig har eksperimentelle metoder for å dyrke CSC fra pasienter blitt utviklet for flere applikasjoner 4,5,6,7. Spesielt ved å utnytte karakteristikken til CSC-er for å vokse ved å danne sfæroider i ultralave festeplater med serumfritt medium, induseres de dyrkede CSC-ene til å uttrykke en stamcelleoverflatemarkør som ikke uttrykkes i normale tumorceller med multilineagedifferensieringspotensial 8,9.
Nylige data har vist at persistensen av sovende ovarie (O) CSCs visualisert som formidling i bukhinnen er assosiert med deres regenerering som tilbakevendende svulster10. Forståelse av de molekylære og biologiske egenskapene til OCSCs kan dermed muliggjøre effektiv målretting og utryddelse av disse cellene, noe som resulterer i potensiell tumorremisjon. Spesielt er lite kjent om de cellulære og molekylære mekanistiske egenskapene til CSCs roller i angiogenese11. I denne protokollen brukte vi derfor pasientavledede OCSC-er in vitro-setting for å undersøke endotelcellenes angiogene egenskaper ved hjelp av kokulturmodellen, som kan etterligne tumormikromiljøet til CSC og endotelceller på det metastatiske stedet i klinisk setting. Til syvende og sist, da neovaskularisering utgjør en kritisk prosess som er nødvendig for å støtte tumorvekst og metastase, vil en bedre forståelse av mekanismen tillate utvikling av en ny målrettingsterapi for OCSCs på det metastatiske stedet.
Her presenterer vi en protokoll for å visualisere neovaskulariseringstrinnet rundt CSC-ene på en tidskursmåte. Fordelen med protokollen inkluderer å tillate fullt reproduserbare undersøkelser ved bruk av 3D-kokultursystemet, NICO-1, og dermed tillate observasjon av effektene på pasienter av OCSC-avledet tumorinitieringsevne under endotelcelleangiogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver hvordan man etterligner tumormikromiljøet til OCSCs i en in vitro-innstilling. Den primære komponenten i metoden utgjør den svært reproduserbare kokulturmodellen oppnådd ved bruk av NICO-1-systemet, et indirekte Transwell-kokultursystem. Mange av de tilgjengelige kokulturmodellene undersøker effekten av direkte cellekontakt på kokulturerte cellepopulasjoner 12,13,14,15,16,17,18.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research C (stipend nr. 19K09834 til K.N.) fra departementet for utdanning, vitenskap og kultur, Japan.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
