Utvärdering av de angiogenetiska egenskaperna hos äggstockscancer stamliknande celler med hjälp av det tredimensionella samodlingssystemet, NICO-1
Summary
Stamceller från äggstockscancer (OCSC) är ansvariga för cancerinitiering, återfall, terapeutisk resistens och metastasering. OCSC-vaskulär nisch anses främja självförnyelse av OCSC, vilket leder till kemoresistans. Detta protokoll utgör grunden för att upprätta en reproducerbar OCSC-vaskulär nischmodell in vitro.
Abstract
Cancerstamceller (CSC) finns i en stödjande nisch och utgör en mikromiljö bestående av intilliggande stromaceller, kärl och extracellulär matris. CSC: s förmåga att delta i utvecklingen av endotel utgör en viktig egenskap som direkt bidrar till den allmänna förståelsen av mekanismerna för tumorigenes och tumörmetastaser. Syftet med detta arbete är att etablera en reproducerbar metodik för att undersöka tumörinitieringsförmågan hos äggstockscancerstamceller (OCSC). Häri undersökte vi neovaskulariseringsmekanismen mellan endotelceller och OCSC tillsammans med de morfologiska förändringarna av endotelceller med hjälp av in vitro-samodlingsmodellen NICO-1. Detta protokoll möjliggör visualisering av neovaskulariseringssteget som omger OCSC på ett tidsförloppssätt. Tekniken kan ge insikt om de angiogenetiska egenskaperna hos OCSC vid tumörmetastaser.
Introduction
Äggstockscancer är den åttonde vanligaste maligniteten hos kvinnor i världen, med cirka 300 000 nya diagnoser och uppskattningsvis 180 000 dödsfall årligen1. Vid första diagnosen uppvisar äggstockscancer ofta svåra symtom, med cirka 75% av patienterna redan i steg III-IV. Följaktligen är 5-årsöverlevnaden <30% och dödligheten är den högsta bland gynekologisk cancer2, med effektiviteten i behandlingen för äggstockscancer som är mycket beroende av kliniska faktorer som framgångsrik prestation av debulkingkirurgi, resistens mot kemoterapi och återfall efter den första behandlingen.
Äggstockscancervävnader är hierarkiskt organiserade, med inte alla tumörkomponenter som är lika kapabla att generera ättlingar. De enda celler som kan förnya sig själv och producera en heterogen tumörcellspopulation anses representera cancerstamceller (CSC)3. CSC-självförnyelse och tumörinitiering åtföljs av främjande av angiogenes för att omforma sin tumörmikromiljö i syfte att upprätthålla en stödjande nisch. Tidigare modeller kunde dock inte användas för in vitro-analyser på grund av den begränsade reproducerbarheten av att odla CSC härledda från kliniska prover på grund av störningen av sfäroider efter flera passationer. På senare tid har experimentella metoder för att odla CSC från patienter utvecklats för flera applikationer 4,5,6,7. I synnerhet, genom att utnyttja egenskaperna hos CSC för att växa genom att bilda sfäroider i ultralåga fästplattor med serumfritt medium, induceras de odlade CSC: erna att uttrycka en stamcellsytmarkör som inte uttrycks i normala tumörceller med multilineagedifferentieringspotential 8,9.
Nya data har visat att persistensen av vilande äggstockar (O) CSC visualiserade som spridning vid bukhinnan är associerad med deras regenerering som återkommande tumörer10. Att förstå de molekylära och biologiska egenskaperna hos OCSC kan således möjliggöra effektiv inriktning och utrotning av dessa celler, vilket resulterar i potentiell tumörremission. I synnerhet är lite känt om de cellulära och molekylära mekanistiska egenskaperna hos CSC: s roller i angiogenes11. Därför använde vi i detta protokoll patient-härledda OCSC i en in vitro-miljö för att undersöka den angiogena egenskapen hos endotelceller med hjälp av samodlingsmodellen, som kan efterlikna tumörmikromiljön hos CSC och endotelceller på den metastatiska platsen i den kliniska miljön. I slutändan, eftersom neovaskularisering utgör en kritisk process som är nödvändig för att stödja tumörtillväxt och metastasering, kommer en bättre förståelse av dess mekanism att möjliggöra utvecklingen av en ny inriktningsterapi för OCSC på den metastatiska platsen.
Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera neovaskulariseringssteget som omger CSC: erna på ett tidskurssätt. Fördelen med protokollet inkluderar att tillåta helt reproducerbara undersökningar med hjälp av 3D-samodlingssystemet, NICO-1, vilket möjliggör observation av effekterna på patienter av den OCSC-härledda tumörinitieringsförmågan under endotelcellsangiogenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver hur man efterliknar tumörmikromiljön hos OCSC i en in vitro-miljö. Den primära komponenten i metoden utgör den mycket reproducerbara cokulturmodellen erhållen med hjälp av NICO-1-systemet, ett indirekt Transwell-samodlingssystem. Många av de för närvarande tillgängliga cokulturmodellerna undersöker effekterna av direkt cell-cellkontakt på cocultured cellpopulationer 12,13,14,15,16,17,18.<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag-i-stöd för vetenskaplig forskning C (bidrag nr 19K09834 till K.N.) från ministeriet för utbildning, vetenskap och kultur, Japan.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. Cancer Research. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. Cancer Research. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
