Summary

تنقية توبولين مع التعديلات ما بعد النقل الخاضعة للرقابة وIsotypes من مصادر محدودة من قبل دورات البلمرة- Depolymerization

Published: November 05, 2020
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول تنقية التوبولين من مصادر صغيرة / متوسطة الحجم مثل الخلايا المستزرعة أو أدمغة الماوس الواحدة ، وذلك باستخدام دورات البلمرة وإزالة البوليمر. يتم إثراء التوبولين المنقى في أنواع متساوية محددة أو لديه تعديلات محددة بعد النقل ويمكن استخدامه في فحوصات إعادة تشكيل المختبر لدراسة ديناميكيات microtubule والتفاعلات.

Abstract

أحد الجوانب الهامة لدراسات الهيكل الخلوي microtubule هو التحقيق في سلوك microtubule في تجارب إعادة تشكيل المختبر. أنها تسمح بتحليل الخصائص الجوهرية لل microtubules، مثل الديناميات، وتفاعلاتها مع البروتينات المرتبطة microtubule (MAPs). “رمز توبولين” هو مفهوم الناشئة التي تشير إلى isotypes توبولين مختلفة ومختلف التعديلات ما بعد النقل (PTMs) والمنظمين للخصائص microtubule والوظائف. لاستكشاف الآليات الجزيئية للشفرة التوبولين, من المهم إجراء تجارب إعادة تشكيل في المختبر باستخدام tubulin تنقية مع isotypes محددة وPTMs.

حتى الآن، كان هذا تحديا من الناحية الفنية كما توبولين الدماغ، والذي يستخدم على نطاق واسع في التجارب المختبرية، ويؤوي العديد من PTMs ولها تكوين isotype محددة. ومن ثم، وضعنا هذا البروتوكول لتنقية التوبولين من مصادر مختلفة ومع التراكيب isotype مختلفة وPTMs التي تسيطر عليها، وذلك باستخدام النهج الكلاسيكي من البلمرة ودورات إزالة البوليمر. بالمقارنة مع الأساليب القائمة القائمة على تنقية تقارب، وهذا النهج ينتج نقية، البلمرة المختصة التوبولين، كما يتم التخلص من أنبوبولين مقاومة للبوليمرة أو إزالة البوليمر خلال خطوات تنقية المتعاقبة.

نحن نصف تنقية التوبولين من خطوط الخلية ، التي تزرع إما في التعليق أو كثقافات معتنقة ، ومن أدمغة فأرة واحدة. تصف الطريقة أولا توليد كتلة الخلية في كل من إعدادات التعليق والتمسك ، وهي خطوة التحلل ، تليها المراحل المتعاقبة لتنقية التوبولين عن طريق دورات البلمرة والتخلص من البوليمر. تنتج طريقتنا التوبولين الذي يمكن استخدامه في التجارب التي تعالج تأثير رمز التوبولين على الخصائص الجوهرية للميكروبات وتفاعلات microtubule مع البروتينات المرتبطة بها.

Introduction

تلعب الخلايا الدقيقة أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الخلوية. أنها تعطي الخلايا شكلها، وبناء المغزل ميوتيك وميتوتيك للفصل الكروموسوم، وبمثابة مسارات للنقل داخل الخلايا. لأداء هذه الوظائف المتنوعة، تنظم البيبات الدقيقة نفسها بطرق مختلفة. أحد الأسئلة المثيرة للاهتمام في هذا المجال هو فهم الآليات الجزيئية التي تسمح للخلايا الدقيقة المحفوظة هيكليا وتطوريا بالتكيف مع هذا العدد الكبير من المنظمات والوظائف. آلية واحدة محتملة هي تنويع microtubules ، والتي يتم تعريفها من خلال المفهوم المعروف باسم “رمز توبولين”1،2،3. يتضمن رمز توبولين عنصرين رئيسيين: الدمج التفاضلي للمنتجات الجينية α β-توبولين (أنواع توبولين) في الأنابيب الدقيقة وتعديلات ما بعد النقل الأنبوبي (PTMs).

منذ السبعينيات، مهدت تجارب إعادة تشكيل المختبر، إلى جانب تقنيات المجهر الخفيف المتطورة، الطريق لاكتشافات مهمة حول خصائص الميكروبات: عدم الاستقرار الديناميكي4 والمطحنةوآلياتها ووظائفها الأخرى6و7و8و9و10و11و12و13و14و15. تقريبا جميع التجارب في المختبر التي أجريت حتى الآن وقد استندت على tubulin تنقيتها من أنسجة المخ باستخدام دورات متكررة من البلمرة وإزالة البوليمر16،17. على الرغم من أن تنقية من أنسجة الدماغ يمنح ميزة الحصول على توبولين عالية الجودة بكميات كبيرة (عادة كميات غرام), عيب واحد مهم هو التغايرية كما tubulin تنقيتها من أنسجة الدماغ هو مزيج من isotypes توبولين مختلفة ويتم إثراء مع العديد من PTMs توبولين. هذا التغايرية يجعل من المستحيل تحديد دور PTM توبولين معينة أو isotype في السيطرة على خصائص microtubule والوظائف. وبالتالي، إنتاج التوبيولين التجميع المختصة مع PTMs توبولين الخاضعة للرقابة وتكوين isotype متجانسة أمر ضروري لمعالجة الآليات الجزيئية للرمز توبولين.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نهج لتنقية التوبولين عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب باستخدام TOG microtubule ملزمة (الجينات المفرطة في التعبير عن الورم) مجال الخميرة Stu2p18. في هذه الطريقة ، يتم تمرير التوبولين في اللخص الخام من الخلايا أو الأنسجة من خلال عمود حيث يرتبط بمجال TOG المشلولين بالمصفوفة ، والذي يسمح بتحليل بركة التوبولين بأكملها لعينة معينة ، حتى صغيرة جدا. كما تم وصف نهج طال انتظاره لتنقية التوبولين المؤتلف في السنوات الأخيرة. وهو يقوم على نظام فيروس الباكولو ، حيث يتم التعبير عن ناقل ثنائي ال سيسترونيك يحتوي على جينات α β توبولين في خلايا الحشرات19. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة مرهقة جدا وتستغرق وقتا طويلا، وبالتالي تستخدم في الغالب لدراسة تأثير الطفرات التوبولين20 وأنابيب isotypes21،22،23 في المختبر.

في البروتوكول الحالي، ونحن نصف الطريقة التي تستخدم راسخة وتستخدم على نطاق واسع نهج البلمرة-depolymerization كمخطط لتوليد توبولين مع مستويات مختلفة من التعديل إما من خطوط الخلية أو من أنسجة الدماغ الماوس24. في هذا الإجراء، يتم تدوير التوبولين بين القابل للذوبان (أنبوبي ديمر في 4 درجة مئوية) وشكل بلمرة (microtubule في 30 درجة مئوية في وجود جوانوسين 5′-ثلاثي الفوسفات [GTP]). يتم فصل كل نموذج من خلال خطوات متتالية من الطرد المركزي: ستبقى أجهزة الدرنات في النتواة الفائقة بعد دوران بارد (4 درجة مئوية) ، في حين سيتم إعادة الكريات الدقيقة عند 30 درجة مئوية. وعلاوة على ذلك، يتم تنفيذ خطوة واحدة البلمرة في ارتفاع piperazine- N،N′-bis(2-ethanesulfonic حمض) (PIPES) التركيز، والذي يسمح لإزالة البروتينات المرتبطة microtubule من microtubules وبالتالي، من tubulin تنقية أخيرا. Tubulin تنقيتها من خلايا هيلا S3 نمت كما تعليق أو الثقافات المنضمة خالية تقريبا من أي PTM tubulin وقد استخدمت في التجارب الأخيرة في المختبر إعادة تشكيل25,26,27,28. لقد قمنا كذلك بتكييف الطريقة لتنقية التوبولين من أدمغة فأرة واحدة ، والتي يمكن استخدامها لعدد كبير من نماذج الماوس مع تغييرات في أنواع التوبولين وPTMs.

في البروتوكول، ونحن أول وصف جيل من المواد المصدر (كتلة الخلية أو أنسجة الدماغ)، تحلل لها (الشكل 1A)،تليها الخطوات المتتالية من البلمرة توبولين وإزالة البوليمر لتنقية التوبولين (الشكل 1B). ونحن كذلك وصف عملية لتقييمنقاء (الشكل 2A، B)وكمية (الشكل 3A، B) من tubulin المنقى. ويمكن تكييف هذه الطريقة لإنتاج التوبولين المخصب مع PTM مختارة عن طريق الإفراط في التعبير عن انزيم تعديل في الخلايا قبل تنقية التوبولين (الشكل 4B). بدلا من ذلك، يمكن إضافة الإنزيمات المعدلة للتوبولين إلى التوبولين أثناء عملية التطهير. وأخيرا، يمكننا تنقية tubulin تفتقر إلى isotypes محددة أو PTMs من أدمغة الفئران ناقصة في الإنزيمات تعديل tubulin المقابلة (الشكل 4B)29.

الطريقة التي نصفها هنا لها ميزتان رئيسيتان: (1) أنها تسمح بإنتاج كميات كبيرة بما فيه الكفاية من التوبولين في وقت قصير نسبيا ، و (2) تولد توبولين نقي عالي الجودة ، مع تكوين أي نوع توبولين محدد أو PTMs. في الفيديو المصاحب لهذه المخطوطة، نسلط الضوء على بعض الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها هذا الإجراء.

Protocol

وقد أجريت رعاية الحيوانات واستخدامها لهذه الدراسة وفقا لتوصيات الجماعة الأوروبية (2010/63/UE). وقد وافقت لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد كوري CEEA-IC #118 (التفويض رقم 04395.03 الصادر عن السلطة الوطنية) على الإجراءات التجريبية امتثالا للمبادئ التوجيهية الدولية. 1. إعداد الكواشف لتنقية توبو…

Representative Results

الهدف الرئيسي من هذه الطريقة هو إنتاج عالية الجودة، والتوبيولين الجمعية المختصة بكميات كافية لإجراء التجارب المتكررة في المختبر مع المكونات المنقى. ويمكن استخدام Microtubules تجميعها من هذا tubulin في إعادة تشكيل المقايسات على أساس الانعكاس الداخلي الكلي fluorescence (TIRF) تقنية المجهر مع microtubules إما دي?…

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يوفر منصة لتوليد بسرعة عالية الجودة، والتوبيولين التجميع المختصة بكميات متوسطة كبيرة من خطوط الخلية وأدمغة الماوس واحد. وهو يقوم على بروتوكول الذهب القياسية لتنقية التوبولين من العقول البقرية المستخدمة في هذا المجال لسنوات عديدة16،17….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل ANR-10-IDEX-0001-02، وLabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 ومعهد التقارب Q-life ANR-17-CONV-0005. ويدعم CJ من قبل معهد كوري، تمنح الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث ANR-12-BSV2-0007 و ANR-17-CE13-0021، ومنحة المعهد الوطني للسرطان (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1، ومنحة مؤسسة من أجل لا ريشرش الطبية (FRM) DEQ20170336756. يتم دعم MMM من قبل منحة الزهايمر Fondation Vaincre FR-16055p ، ومنحة الزهايمر الفرنسية AAP SM 2019 n°2023. وقد تم دعم JAS من قبل الاتحاد الأوروبي أفق 2020 برنامج البحث والابتكار في إطار اتفاق منحة ماري Skłodowska-كوري رقم 675737، ومنحة FRM FDT201904008210. تم دعم SB من قبل منحة FRM FDT201805005465.

نشكر جميع أعضاء مختبر جانكي، ولا سيما ج. شورون، وكذلك ج. لاكيسيتش (معهد MICALIS، AgroParisTech) وأ. غوتريو (المدرسة البوليتكونيكية) على المساعدة أثناء وضع البروتوكول. نود أن نشكر منشأة الحيوانات في معهد كوري للمساعدة في تربية الفئران والرعاية.

تم الحصول على الأجسام المضادة 12G10، التي وضعها ج. فرانكل و M. نيلسون، من بنك الدراسات التنموية الهجينة وضعت تحت رعاية NICHD وصيانتها من قبل جامعة أيوا.

Materials

1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Play Video

Cite This Article
Bodakuntla, S., Jijumon, A., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

View Video